[发明专利]一种检测禽流感病毒通用亚型的液相芯片方法

权利要求书

1.一种用液相芯片方法检测禽流感病毒通用亚型的引物，其核苷酸序列为：

M-FP：5’-CAAGACCAATCCTGTCACCT-3’，

M-RP：5’-GGGTCTCCATTCCCATTTAG-3’，在M-RP引物的5’端用生物素标记。

2.一种用液相芯片方法检测禽流感病毒通用亚型的探针，其核苷酸序列为：5’-GTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3’，在其5’端用氨基修饰。

3.一种液相芯片，其特征在于，是权利要求2所述的特异性检测探针与荧光标记微球偶联制成的特异性检测微球。

4.一种用液相芯片检测禽流感病毒通用亚型的方法，其特征在于，用权利要求1所述的引物，对样品RNA进行RT-PCR反应，将带生物素标记的RT-PCR产物与权利要求3所述的液相芯片进行分子杂交后，检测荧光值，确定样品中是否含有禽流感病毒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)提取样本中禽流感病毒RNA；

2)以步骤1)提取的样本RNA为模板，以权利要求1所述的引物进行RT-PCR反应；

3)将权利要求2所述的探针与荧光标记微球偶联；

4)杂交：将带有生物素标记的步骤2)中的RT-PCR产物与步骤3)中的偶联到荧光微球上的探针在PCR仪上杂交；

5)检测荧光值，以平均荧光值大于100且为空白对照3倍以上荧光值所对应的检测标本为阳性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)的RT-PCR反应50μL反应体系为：一步法RT-PCR 5×buffer 10.0μL，10mmol/LdNTP 2.0μL，酶混合物2.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL，RNA模板5.0μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物1.0μL，不含RNA酶的ddH₂O 29.0μL；RT-PCR反应条件为：50℃30min；95℃15min，94℃30s，52℃40s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中步骤3)中每1.25×10⁶个荧光微球加入浓度为0.1nmol/μL的特异性探针4μL。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中步骤4)采用以下方法进行杂交：杂交体系为50μL，其中微球33μL，步骤2)中的PCR产物为5μL，加入TE补充体积至50μL；杂交条件为：95℃变性5min后，50℃杂交30min。

9.一种试剂盒，其特征在于，含有特异性检测探针，其序列为：5’-GTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3’，在其5’端用氨基修饰。

10.权利要求3所述的液相芯片和权利要求9所述的试剂盒在检测禽流感病毒通用亚型中的应用。