[发明专利]一种克隆山羊PID1基因编码区全序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种克隆山羊磷酸酪氨酸互作结构域1(Phosphotyrosine interactiondomain containing 1，PID1)基因编码区全序列的方法。

背景技术

磷酸酪氨酸互作结构域(PID1)是以抑制性消减杂交(Suppression subtractivehybridization，SSH)技术筛选肥胖与正常人腹膜后脂肪组织中的差异表达基因，研究人员曾按其工作单位和姓氏的首个英文字母将该基因命名为NYGGF4基因，提交NCBI后，根据该基因的结构特征被国际统一命名为PID1基因。该基因有一个PTB(磷酸酪氨酸作用位点)结构域，与信号蛋白Shc上的PTB结构域相似，参与生长因子刺激下细胞增殖等下游效应。PID1基因在3T3-L1脂肪细胞中过表达能够显著下调脂肪细胞胰岛素信号途径中与胞膜葡萄糖转运密切相关的基因-葡萄糖转运子4(GLUT4)的表达，从而推测PID1基因可能参与了多种组织的胰岛素敏感性调节，而脂肪细胞胰岛素敏感性的高低与脂肪沉积密切相关，研究发现PID1基因过表达通过下调胰岛素刺激的GLUT4的转位而减少脂肪细胞的葡萄糖摄取率，其机制与抑制PI3K/AKT信号通路、减少GLUT4向胞膜转位有关，推断它的过量表达可能促进了脂肪细胞的增殖，并抑制了葡萄糖的转换，进而影响机体的胰岛素敏感性，导致脂肪的沉积，山羊肌内脂肪的含量对羊肉品质具有直接影响，研究该基因的作用和功能将对动物遗传改良和培育新品系提供理论基础。

RT-PCR克隆：是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因中，然后用质粒PCR产物测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难于得到的PCR产物；克隆载体PCR测序能克服PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE(cNDA末端快速扩增)技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本低，工作量小。该技术成功的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计上游引物，在终止密码子的下游设计下游引物，使得PCR产物包含完整的基因编码区全序列。

分段PCR克隆法：将目的基因分成几段来分别克隆，然后做亚克隆测序拼接。成本高，工作量大耗时，一个基因分成几段就需要做几次克隆，然后再做序列接拼。

现有技术中采用RACE(cNDA末端快速扩增)技术：是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。1、目的PCR产物的基因片段长度不明确。2、试验成本高。3、工作量大，实验技术要求高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快捷的获取山羊PID1基因的完整编码区序列的方法，填补了该基因在山羊上的空白。

本发明采用以下技术方案：

一种克隆山羊PID1基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：

A1、提取山羊腹肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

A2、引物的设计及PCR反应：以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物；设计的引物为：

上游引物P 1：5′-CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3′

下游引物P2：5′-TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3′

用cDNA为模板进行梯度PCR操作确定普通PCR的扩增条件，温度为范围在50℃到65℃之间的8个温度点.PCR反应体系为10ul体系(5μL的2×Master Mix Tap，上下游引物各0.5μL，2μL的cDNA，2μL的ddH₂O.)，反应条件为95℃预变性5min，38个循环(94℃，30s；61℃，40s；72℃，40s)，最后72℃7min；

A3、PCR产物的回收和纯化；

A4、克隆。