[发明专利]一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种DNA纯化的方法，特别涉及一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法。

(二)背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。通常认为SNP只有两种类型，即等位基因，在对已知SNP位点检测分型时只需对SNP进行两种不同类型碱基的确认分析。SNP广泛存在于低等和高等生物中，在人类基因组中约有300多万个。SNP具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，它与许多疾病直接相关，如血友病和苯酮尿病等，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。因此，对SNP的分型在临床检验和诊断、新药研究、个性化用药等领域显得极其重要。越来越多的SNP分型方法被快速发展起来，如引物延伸法、寡核苷酸连接反应法、内切酶酶切法、等位基因特异性杂交法等，其中，基于PCR扩增的引物延伸法因其简单、高效、经济等特点，被使用的最为广泛。引物延伸法中一个共同特性是通常需要用PCR方法首先扩增得到含目的SNP位点的扩增产物，对其进行纯化后，将其作为模板DNA再用于后续的等位基因分型。一般来讲，引物延伸法对模板DNA的纯度要求较高，因此，在用引物延伸法进行SNP分型中，发展一种有效、经济、简单的纯化PCR产物的方法显得尤为重要。被称为OLE(One-label Extension，单标记延伸)的方法(薛红、王子晖.单核苷酸多态性及点突变的检测方法.中国发明专利，专利申请号：200410029526.9，申请日：2004.3.18)就是一种引物延伸法，该方法是根据下列事实：紧邻在任何一个SNP位置之5’端的核苷是已知的，且紧接于该位置之3’端的相邻序列也是已知的；一个互补于紧邻在靶多核苷酸内SNP3’侧之序列的引物被用于链延伸；聚合酶反应混合物包含有一个链终止核苷酸，该链终止核苷酸所具有的碱基互补于紧邻该靶多核苷酸之SNP5’侧的核苷酸；可加入一个额外的dNTP以产生一个最多有两个碱基延伸的引物；对引物的链延伸长度或者从终止核苷酸标记了的形式渗入的标记量，以所形成的延长/终止反应产物来区分。该方法被成功发展建立并用于SNP的分型以研究SNP与精神分裂症的相关性(Zhiliang Yu，Jianhuan Chen，Haifeng Shi，Gerald Stoeber，Shui-Ying Tsang，Hong Xue(2006).Analysis of GABRB2 association with schizophrenia in German population with DNA sequencing and one-label extension method for SNP genotyping.Clinical Biochemistry 39(3)：210-218.)，分型检测成功率为100％，显示了良好的应用前景。但是，一个较大的限制因素是：该方法对含目的SNP位点的PCR扩增后获得的模板DNA的纯度要求较高，由此需要用DNA纯化柱对PCR扩增产物进行纯化，从而导致每个分型成本达到了10元左右(主要是DNA纯化柱的成本)，大大高于其他一些分型方法的价格(1元左右的成本)，这极大的限制了该方法的产业化应用。模板DNA纯化成本过高也是其他一些引物延伸法中的一个共性问题，所以，发展建立一种经济、廉价及简单的纯化PCR扩增产物的方法，显得极为重要。