[发明专利]一种鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法

权利要求书

1.一种鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是，它包括以下步骤：

⑴ 制备鸡胚成纤维细胞悬液：使用胰酶连续消化法将9日龄SPF鸡胚制成鸡胚成纤维细胞悬液；

⑵ 细胞培养：用细胞生长液将鸡胚成纤维细胞悬液稀释成细胞密度0.9×10⁶个/ml ~ 1.1×10⁶个/ml，接种于细胞培养板中，每孔加入1ml细胞悬液，置CO₂培养箱中培养，至长满细胞单层，备用； 

⑶ 稀释病毒液：采用旋涡混悬器混匀方法，用细胞维持液1×10⁴、5×10⁴倍稀释待测定的病毒液，得到梯度浓度的病毒液；

⑷ 病毒接种及培养：弃去步骤⑵细胞培养板中细胞生长液，并按0.2ml/孔加入步骤⑶所得稀释病毒液，每个稀释度接5个孔，置CO₂培养箱中吸附1h，接毒孔再加入细胞维持液1.5ml/孔；同时将细胞培养板未接毒孔中加入细胞维持液，1.5ml/孔，每个稀释度对应1孔，设置为阴性对照；细胞培养板置CO₂培养箱中培养；

⑸ 蚀斑计数：病毒接种后培养4~5天，待病毒蚀斑充分生长时，在倒置显微镜下对细胞培养板中相应的蚀斑进行计数；

⑹ 毒价计算：阴性对照培养孔无蚀斑出现的细胞培养板为有效板，根据有效板的各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的病毒液的毒价。

2.根据权利要求1所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：在步骤⑵中，使用的细胞生长液配方为：体积百分含量90%~92%的M-199营养液，8%~10%新生牛血清，用NaHCO3调整pH值为7.2~7.5。

3.根据权利要求2所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：所述细胞培养板为24孔细胞培养板。

4.根据权利要求3所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：在步骤⑵、⑷中，所述CO₂培养箱中CO₂体积含量为4%~6%、温度设定为37℃~38℃。

5.根据权利要求4所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：在步骤⑶中，使用旋涡混悬器混匀病毒液，所述旋涡混悬器转速300rpm，混匀时间10s~20s。

6.根据权利要求5所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：在步骤⑶、⑷中，所述细胞维持液配方为：体积百分含量97%~98%的M-199营养液，2%~3%新生牛血清，调整pH值为7.2~7.5。

7.根据权利要求6所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：在步骤⑸中，所述蚀斑判定方法为：在显微镜下，视野中可见一个或多个细胞圆缩、堆积成簇的病变区域，病变细胞具有折光性，病变区域边缘不整齐、整体呈菜花样，一个病变区域即为一个蚀斑。

8.根据权利要求7所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：在步骤⑸中，病毒蚀斑计数时机的确定，一般在接毒后第4天计数，如果蚀斑偏小（眼观如针尖大小），可在接毒后第5天计数。

9.根据权利要求8所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：在步骤⑹中，待测定的病毒液的毒价的计算方法：毒价以1ml病毒液中所含有的蚀斑形成单位的数目来表示，计算公式为：

毒价=  最适稀释倍数各孔蚀斑的算数平均数×最适稀释倍数  

                         每孔接种病毒液体积。

10.根据权利要求9所述的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，其特征是：所述最适稀释倍数判定标准为：在该病毒液稀释倍数下，生成的蚀斑清晰、无融合重叠、蚀斑数在10～30个范围，判定为最适稀释倍数。