[发明专利]分离及培养大胚龄人神经干细胞原代细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高低密度法分离及培养大胚龄人神经干细胞原代细胞的方法。

背景技术

神经干细胞具有广阔的临床应用前景，细胞替代治疗可以治疗帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病和阿耳茨海默氏病等神经退行性疾病以及脑卒中、脑外伤等引起的神经功能缺失，神经干细胞作为基因治疗的载体，可以治疗帕金森氏病、粘多糖病和颅内肿瘤等。但是，神经干细胞的研究目前尚处于初期阶段，有许多问题还没有得到解决，如神经干细胞如何在体内和体外定向分化为我们需要的某种特定的神经细胞，体外分离得到的神经干细胞与体内的是否有差异等等，这些都需要进一步的研究。

神经干细胞的发现和研究是近十年来神经生物学领域最重要的进展之一，近年来不断有实验发现人胚脑和其它哺乳类动物一样存在具有自我更新和广泛分化潜能的神经干细胞，如何快速有效地分离培养出人胚神经干细胞并长期传代扩增是进一步研究神经干细胞的前提条件。由于胚龄越大，神经干细胞越难分离培养，以往学者[1，2]常用小胚龄胚胎(7～9周)分离培养神经干细胞，而大胚龄胚胎神经干细胞的分离和培养的研究则较少。

发明内容

本发明应用高、低密度培养法从13周龄人胚胎大脑皮层中分离和培养出神经干细胞，并用免疫荧光法予以鉴定。

具体的，本发明的高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法步骤包括：

S1：原代细胞的分离培养：取13周水囊引产的新无菌条件下分离出大脑皮层组织，剥除脑分成小块后在PBS液中漂洗三次洗去血细胞，用细吸管轻柔吹打至组织碎块完全散开，离心洗涤后吹打制成悬液，经200目尼龙滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含B27(1∶50)(GibcoBRL)和EGF(Serotec)20ng/ml、bFGF(Chemicon)20ng/ml的DMEM/F12(1∶1)(GibcoBRL)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，将原代细胞短暂贴壁2次去除成纤维细胞，分别种植于未包被的25cm2培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37℃，5％CO2条件下静置培养。培养方法分为悬浮细胞培养法和贴壁培养细胞法，悬浮细胞培养法7天后首次换液时重新计数活细胞，以1×10⁵/ml密度分瓶继续培养。我们采用的贴壁细胞培养法与通常贴壁细胞培养法有所不同，每次换液时吸取上悬液离心后加新鲜培养基种入新的培养瓶，原瓶中仅保留贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养。

S2：神经干细胞的传代培养：原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养。采用严格无菌操作，在倒置显微镜下用自制玻璃微针将其中的大克隆球(大于350～500μm)切成数块，小克隆球(小于100μm)不作处理继续培养。根据克隆球生长情况7～10天传代一次，方法同前。

S3.单细胞定点动态观察克隆形成：在贴壁细胞培养法中挑选散在的出现明显增大具有强折光性的细胞，在培养瓶底面用记号笔分别标记，动态定点观察并照相记录。当单个细胞形成克隆球并逐渐增大即将悬浮脱离时，用自制玻璃微管(内径约250～500μm)逐个吸出克隆球进行分化试验。

S4.诱导分化培养：将以上获得的来自单细胞的克隆球用胰酶消化和胎牛血清终止后分别种植于直径315cm预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用有血清培养基DM EM/F12+5％Fcs进行分化培养。

S5.免疫荧光法检测：将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿，用无血清培养基贴壁培养12小时后行免疫荧光检测。经分化培养后的细胞分别于2、7和14天行免疫荧光检测。每个培养皿用油性记号笔画五个圈，分别用抗Nestin Ig G、抗N SEIg G、抗GFAP IgG、抗CNP IgG和空白对照行免疫荧光染色，二抗为FITC荧光二抗。神经干细胞传代时，培养基中加入Brdu(5μmol/L)，连续传代两次后种入包被的小培养皿，贴壁培养12小时后行免疫荧光检测。

本发明的高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法，先采用高密度，后降低密度的原代细胞悬浮培养法，可以快速形成克隆球，克隆球开始形成时间比维持低密度培养明显提前，并且生长迅速。而一旦进入有丝分裂期形成克隆球，则必须及时降低密度，以避免高密度的抑制作用。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：

图1所示为本发明的高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法步骤流程图；

图2所示为本发明的分离培养大胚龄人神经干细胞的原代细胞的步骤流程图。