[发明专利]同时检测四种病毒的引物、引物对、方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的检验技术。具体地讲，本发明涉及利用兰花病毒专一性引物及引物对同时检测数种兰花病毒的检验技术。

背景技术

兰花是重要花卉产品，极具经济价值，其中又以蝴蝶兰为主要花卉。例如，台湾的出口量历年来呈现正向成长现象，于2009年出口金额已达20亿台币。兰花跟所有植物一样，于栽培过程中都可能面临病虫害的威胁，而导致生长与质量上的损失。对于大多数感染兰花的病害而言，只要运用传统的防治方法例如施用药剂，均可获得良好的防治效果，唯独由滤过性病毒所感染的病毒病至今仍缺乏有效的治疗对策。因此，病毒造成的病害可说是目前最困扰兰花产业的病害。

病毒之所以成为兰花产业上最受关切的病原，其主要原因在于病毒可在兰花植株上造成全株统性感染，使兰株生长缓慢，叶片出现条纹、斑块、坏疽或绿色分布不均的嵌纹病征。有些敏感的品种在花朵上也会出现色泽不均、畸形或提早凋萎等病征，严重损及兰花的商品价值。

根据文献的纪录，可以感染兰花的病毒种类至少有28种。但证实在台湾地区发生的只有蕙兰(东亚兰)嵌纹病毒(Cymbidium mosaic virus，简称CyMV)、齿舌兰轮斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，简称ORSV)、胡瓜嵌纹病毒(Cucumber mosaic virus，简称CMV)及番椒黄化病毒(Capsicum chlorosis tospovirus，简称CaCV)等四种，其中又以CyMV及ORSV感染情况最普遍，对兰花产业严重影响。在台湾CaCV感染虽不普遍，但由于其感染蝴蝶兰后造成的黄化轮斑与凹陷坏疽病征首在台湾发现，因此CaCV被称为「台湾病毒(Taiwan virus)」，这对台湾蝴蝶兰市场造成相当大的冲击。然而，后续研究发现，世界各国的辣椒、蕃茄、花生及大岩桐早已有感染CaCV的历史，其中茄科作物(如蕃茄、辣椒、甜椒及烟草等)对CaCV有高度感病性，感染后会造成轮斑、萎凋甚至死亡。因此，CaCV虽然在台湾蝴蝶兰感染尚不及CyMV及ORSV普及，但其对农业上可造成的农作损害却非常广泛且严重。

跟所有作物一样，要栽培健康完美的兰花，无病的健康种苗为重要因素。国际市场上对于兰花除了于品种与美观考量外更出现「无病毒健康苗」的竞争。面对国际市场竞争，产业界开始应用「组织培养技术」复制分生苗，降低种苗病毒感染率。以现今蝴蝶兰产业为例，约有二成的种苗乃利用亲本授粉所结的种子繁殖而来，称为「实生苗」，其余约八成的种苗乃藉由无性组织培养技术，将优良性状的植株大量复制成为具有完全相同性状的种苗，这种种苗称为「分生苗」。不过分生苗虽然可以复制其亲本植株的所有优良性状，但也可能继承其亲本所感染的「病毒病」，而影响后续的栽培、生育与开花质量。因此优良性状的兰株必须经过病毒检测程序，确定无病毒感染后，才能进行分生组织培养大量复制分生苗，此种程序已成为现今国际兰花产业界的普识作为。

要确实执行种苗的病毒验证，必须仰赖敏感及有效率的病毒检测技术，才能准确筛选感染病毒的植株。过去二十年来国际上最广泛应用于植物种苗病毒检测的技术为酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)。然而近年来多项研究证据显示兰花受到病毒侵入后常会呈现潜隐性感染，于病组织中仅累积微量病毒，因而超出ELISA的检测范围，导致漏检的情况发生。

已有报导提供「四种兰花病毒免疫快速检测试剂研发的抗原与抗体」，其提供针对ORSV、CyMV、CaCV及CMV等蝴蝶兰病毒的血清检测与高敏感度的核酸检测试剂与技术(请参行政院农业委员会农业试验所技转公告「四种兰花病毒免疫快速检测试剂研发的抗原与抗体」http://www.tari.gov.tw/taric/modules/news/article.php？storyid＝450)。惟，该研究仅提供针对此4种病原进行ELISA的的抗体以及对照抗原，而无揭示关于核酸检测的试剂及技术。

台湾第096120312号发明专利申请案(公开号200848735)揭示一种检测兰花病毒的试剂及方法，其利用分布于溶液中的磁性奈米颗粒，每一磁性奈米颗粒包括磁性层、接口活性剂层及多个兰花病毒抗体。该专利申请案揭示以所述方法检测CyMV、ORSV及CMV。