[发明专利]异源表达内切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种异源表达内切葡聚糖酶基因的工程菌株及其应用。

背景技术

纤维素是由β-1，4-糖苷键连接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最丰富且可再生的资源。据估计，地球上每年光合作用产生1.5×10¹¹亿吨纤维素(Ryu，D.D等，1980，Enzyme and Microbial Technology)。多数情况下，要高值化利用纤维素首先必须通过纤维素酶对其进行有效降解。自然界中产纤维素酶的生物很多，主要是微生物，如丝状真菌、细菌和放线菌等。因此，对产纤维素酶微生物的筛选或遗传改造研究及应用就受到了普遍的关注。

自然界中各种微生物所产的纤维素酶组分和比例不尽相同，例如丝状真菌纤维素酶系(Cellulase system)一般包括3种水解酶，即内切型β-1，4-葡聚糖(Endoglucanase，EC3.2.1.4)、外切型β-1，4-葡聚糖酶(Exo-glucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)(Fogarty M，Kelly C T，1990，Microbial Enzymes and Biotechnology)，3种纤维素酶组分协同作用才能将纤维素水解成葡萄糖。其中木霉(Trichoderma sp.)作为工业化生产纤维素酶的菌株，其纤维素酶系中有2个外切酶组分(Cbh I和Cbh II)和5个内切酶组分(Eg I、Eg II、Eg III、Eg IV和Eg V)。由于木霉具有高效分泌表达和高密度发酵等优点，常被用来构建工程菌生产其它工业酶。而利用基因工程手段高效表达外源基因，也是改变木霉宿主酶系组成的重要方法之一，如通过高效表达异源β-葡萄糖苷酶基因，可以有效弥补木霉纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶的不足，提高菌株的滤纸酶活(Jiwei Zhang等，2010，Bioresource Technology)。目前，纤维素酶系中的各组分均可在木霉中得到有效表达

需要提及的是，木霉纤维素酶系的最适pH值为4.5-5.5，在近中性和碱性条件下(pH6.5-8.0)几乎没有效果。因此，在织布除毛、牛仔布磨损和洗旧的现有工艺中，必须先调pH至酸性，再加纤维素酶。为了进一步简化工序，节约生产成本和劳动量，急需通过遗传工程方法获得在中性和碱性条件下适用的纤维素酶系。

发明内容

本发明的目的是提供一种异源表达内切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其应用，即利用基因工程手段，将特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因转化入木霉中，构建木霉工程菌株。该工程菌能高效表达内切葡聚糖酶基因，从而增加了其纤维素酶系的内切酶组分，提高了酶活性；而意想不到的是，与未转化的木霉相比，本发明构建的木霉工程菌的纤维素酶系的pH适用范围得到了显著扩大，可以在中性或偏碱性条件下直接应用。

申请人在经过长期的筛选后发现，将来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因转化入木霉中，木霉纤维素酶系的pH适用范围得到了显著扩大，从而促成了本发明。

本发明的一个方面涉及一种木霉工程菌，该工程菌携带有能表达特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶的表达载体。

所述的木霉为里氏木霉(Trichoderma reesei)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)中的任一种。

其中里氏木霉YFZX-1(hph⁺，egV)(Trichoderma reesei YFZX-1(hph⁺，egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于地址为武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山的“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO：M 2011469。

康氏木霉YFZX-2(egv)(Trichoderma koningii YFZX-2(egv))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO：M 2011470。