[发明专利]一种定量检测氮末端脑钠肽的荧光免疫层析方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种定量检测氮末端脑钠肽NT-proBNP的荧光免疫层析方法及其试剂盒。

背景技术

1988年日本学者Tetsuji Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，命名为BNP1。以后的研究表明，不只是BNP这一种多肽，而是有一组多肽在生物进化的过程中逐渐发展产生(在人类和脊椎动物至少包括ANP、BNP、CNP和DNP等)，称为利钠肽(NP)家族。其功能是维持循环系统的容量、渗透压和压力调节的稳态。大量基础和临床研究表明，血液中的BNP水平在心力衰竭时显著升高，作为一种新的生物标记物，对心力衰竭的诊断、病程进展的监测、对疗效和预后评估具有重要的价值，还可用于急性心肌梗塞患者在治疗后对其心室功能的恢复状况进行评估。

目前用于临床检测的BNP包括BNP和NT-proBNP两种。虽然两者有相同的生物学来源，但生物学效应和临床意义不完全相同。心肌细胞受刺激后，产生初始基因产物前BNP前体(pre-proBNP)，该肽的一个26氨基信号肽被立即去除，形成含108个氨基酸的的BNP前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、有活性的B型利钠肽(BNP)。BNP的清除主要通过与BNP清除受体结合，而NT-proBNP则主要由肾小球滤过，因此其血浓度受肾功能影响大于BNP。BNP半衰期短(22分钟)，体外稳定性差，而NT-proBNP半衰期较长(120分钟)，体外稳定性强，在心衰患者中的浓度较BNP高，与BNP相比更有利于心衰的诊断。

BNP和NT-proBNP检测在本世纪初先后进入我国，十年来已经为各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。

测定NT-proBNP的主要方法有放射免疫法、电化学发光法、酶联免疫法和胶体金免疫层析法等；放射免疫法采用夹心法测定血浆中NT-proBNP浓度，此法虽较敏感、准确、易于操作，但存在着放射线辐射和污染等问题，且不适合心脏病的急性诊断和小样本检测。电化学发光法较放射免疫法更为敏感、准确，精密，但成本昂贵，需要配套化学发光仪才能检测。酶免疫法(ELISA)存在着操作繁琐，检测耗时长等缺点。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。

中国专利申请号CN201010241048.3公布了一种免疫层析试纸条的测试使用及应用这种测试方法的NT-proBNP快速定量试剂。其采用上转发光材料即UCP作为生物标记物，标记物上结合了NT-proBNP抗体。然而上转换发光材料激发效率较低，需要功率较高的光源激发，且配套的仪器价格昂贵。

中国专利申请号CN200720140931.7公布了一种脑钠肽颜色颗粒诊断试纸。同时专利CN200720140928.5，公布了一种氮末端脑钠肽前体/C-反应蛋白/肌钙蛋白I诊断试纸，利用快速免疫层析法，定性检测临床标本(全血/血清/血浆)中氮末端脑钠肽前体/C-反应蛋白/肌钙蛋白I。其利用金属胶体颗粒(如胶体金)或标记颗粒(如荧光染料颗粒)，定性检测3中标志物。该方法具有灵敏度低、线性范围窄等缺陷。

美国专利US60/576327和60/592202，及其在中国申请的专利200580025931.6都对胶体金免疫层析检测进行了论述。但相比于荧光检测，吸光度检测具有灵敏度低、线性范围窄等缺陷。

因此，研发检测成本低、快速、高灵敏度检测方法及试剂的制备方法，并在国内普及，具有巨大的发展潜力和应用前景。