[发明专利]油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学实验中植物基因组DNA分离提取技术，尤其涉及一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法。

背景技术

基因组DNA的提取是分子生物学实验很重要的一个环节。基因组DNA的质量和产量，直接影响分子生物实验中与DNA有关的后续实验的进行。药用植物、芳香族植物及木本植物富含次生代谢产物；对这一类富含次生代谢产物的植物，传统的DNA提取方法不易提到高质量的基因组DNA。这类植物叶片内次生代谢产物的种类极其复杂，且不同物种间甚至同一物种间不同季节，不同叶龄的叶片间次生代谢产物的异质性程度都较高；因此，一种植物的基因组DNA提取方法往往不能很好地应用于另一种植物基因组DNA的提取。

油桐原产于中国，具有极高的工业价值。从油桐桐果中提取的桐油是我国传统的大宗出口创汇物资。在我国，桐油主要用于油墨和涂料的生产。现今，能源危机不断加剧，环境问题日益严重，对可持续的新型清洁能源的需求迫在眉睫。油桐被选为能源植物物种，从油桐果实中提取的桐油可作为生产生物柴油的原料。因此用先进的分子生物学手段深入地研究油桐资源将对选育高产品种以及将桐油转化为生物柴油提供理论依据和技术支持。目前油桐资源分子方面的研究还处于起步阶段，提取高质量高产量的油桐基因组DNA是开展一系列后续分子生物学实验的基础。油桐叶片富含多糖、单宁、蛋白及多酚类物质，这些次生代谢产物影响油桐基因组DNA的提取。而物种间次生代谢产物的异质性致使其它物种基因组DNA的提取方法并不是油桐基因组DNA的最佳提取方法。研究发现油桐叶片的叶龄影响油桐基因组DNA的提取。

经检索，到目前为止，现有技术中还没有专门针对油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法的报道。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，针对油桐成熟叶片和老叶片富含多糖、单宁、多酚及蛋白的特点，提供一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法(简称方法)。

本发明的目的是这样实现的：

1、本方法包括下列步骤：

①将叶片(指油桐成熟叶片和老叶片)组织样品在液氮速冻下磨成细粉后，取0.3g转入2mL离心管中，加入1.5mL洗液，充分混匀后，冰中静止15min，12000rpm离心弃上清液；

②弃掉洗液后，加入500μl预热的3％CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴40min；

③12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1.5mL离心管中，加入100μl的24∶1的氯仿-异戊醇，充分混匀后，常温12000rpm离心15min，抽提1～2次，抽提后的上清液转入新的离心管中，加入两倍体积的提前预冷到-20℃的100％酒精；放置于-20℃冰柜30min，让DNA沉淀充分析出；将析出的DNA沉淀转移到含有1mL 70％酒精的1.5mL离心管中，漂洗2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100μl的T_0.1E充分溶解，并用1μl浓度为10μg/mLRNA酶37℃消化30min，该过程得到的DNA样品，称为1^stDNA；

④对步骤③中转移上清液后离心管底部的组织样品，继续加入500μl的3％CTAB提取液进行提取，该组织样共循环提取4次，依此又得到3批次DNA样品，分别称为2^ndDNA、3^rdDNA和4^thDNA。

所述100％酒精是指纯的酒精溶液。

所述70％酒精是指70mL纯酒精用无菌纯净水定容到100mL的酒精溶液。

本发明所提取的多批次DNA样品中，未经低温储存的成熟叶片和老叶片1^stDNA、2^ndDNA、3^rdDNA产量较高，浓度大致为300～800ng/μl之间。而4^thDNA的产量大致在50～100ng/μl之间，产量明显降低，可只进行前3次循环提取。

本发明所提取的多批次DNA样品中，长久低温储存的成熟叶片和老叶片1^stDNA产量较低，大致在0～50ng/μl之间，水浴后可弃掉离心产生的上清液，直接进行后续3次DNA的提取；而2^ndDNA、3^rdDNA，产量高，浓度大致为100～500ng/μl之间。

本发明所使用洗液的成分为：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，350mM山梨醇，2％PVP，0.5％β-巯基乙醇，PH值为8.0。