[发明专利]一种长效人血管内皮生长因子165的制备

说明书

技术领域

人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备属于长效重组融合蛋白药物技术领域：涉及DNA重组技术，药物蛋白与HSA的融合使得药物成为长效药物。

背景技术

血管内皮生长因子由Ferrara等于1989年首次在牛垂体星状滤泡细胞体外培养液中纯化获得，可刺激细胞迁移、增殖和内皮细胞表达各种基因，特异地作用于血管内皮细胞诱导体内血管的形成并增加血管通透性的细胞因子，是一种最主要的血管生成因子。在改变心肌缺血、抗动脉粥样硬化、防治动静脉血管损伤和防治血管再狭窄，以及促进心血管、胰岛移植等方面均有重要作用，并为肿瘤治疗的研究开辟了新的途径。VEGF根据VEGFmRNA剪接方式不同分为多个变构体，有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189、VEGF206。VEGF165是体内最多的亚型，其生物活性最强且cDNA扩增丰度最高，故在临床和实验中应用最广，由于其能加速血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)损伤的修复，使血管内血栓形成及血栓性闭塞减少，并抑制内膜增生，倍受国内外研究人员的关注。

然而，由于hVEGF165分子量非常小，体内代谢速度相当快，因此为了达到治疗效果，需要频繁大剂量用药。昂贵的价格和频频用药造成的不便将严重限制了此种药物的应用。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，它除了具有维持血浆渗透压功能以外，还能担当许多内源因子和外源药物的载体，从而调节激素活性，所载物质的毒性，以及药物的利用度。成熟的HSA有585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa，如此大的分子量减小了它在内循环时经肾排泄的量，再正常情况下，不易被肾小球虑过，血浆半衰期在20天左右。同时，HSA在人体内没有酶学和免疫学活性，是一种理想的生物活性蛋白载体。

发明内容

本发明的一个内容是提供hVEGF165与HSA生理特性于一体的人血清白蛋白与人血管内皮生长因子165的融合蛋白，该融合蛋白在保持了人血管内皮生长因子165生理特性的基础上，增加了作用位点，延长了体内半衰期，具有优良的药学特性。

该融合蛋白的基因序列及氨基酸序列如前所述。

本发明的技术方案：在前期的研究中本实验室保藏了重组质粒PIC9K-hVEGF165以及pBluescript-HSA质粒。pBluescript-HSA质粒上只有一个Bsu361I酶切位点在HSA末端，设计含有HSA Bsu361I酶切位点及下游表达区序列的hVEGF165上游引物和含有NotI酶切位点下游引物，扩增得到hVEGF165基因，然后通过限制性双酶切置入HSA下游，获得HSA-hVEGF165融合基因，中间不含任何连接肽序列。将该融合基因插入到克隆载体，转化到宿主系统，融合基因就会整合到宿主的染色体中进行表达。

如此一来，我们制备的人血清白蛋白的融合蛋白与人血管内皮生长因子165，包括与人血清白蛋白至少90％序列同源的第一区和与人血管内皮生长因子165至少90％序列同源的第二区；所述的与人血清白蛋白至少90％序列同源的的第一区位于融合蛋白的N末端，与人血管内皮生长因子165至少90％序列同源第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述的与人血清白蛋白至少90％序列同源的的第一区位于融合蛋白的C末端，与人血管内皮生长因子165至少90％序列同源第二区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽。优选的是所述的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与人血管内皮生长因子165至少95％序列同源的第二区。所述的融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人血管内皮生长因子165氨基酸残基序列相同的第二区，或上述两区的功能等同物。所述的功能等同物是在不改变所述的融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白的个别氨基酸的残基的取代、缺失或加入得到的多肽。

本发明hVEGF165和HSA之间不加任何连接肽，可以避免因连接肽的加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫源性方面的问题。

本发明的第二个内容是提供表达该融合蛋白编码区的宿主和携带该融合蛋白编码区的重组表达载体。