[发明专利]一种提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法及其专用工程菌

权利要求书

1.可提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的工程菌，是将含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体导入大肠杆菌中得到的；所述经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：用于构建所述含有茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因表达载体的出发载体为pET-22b，以pET-22b为出发载体，构建的含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体为pET-MTG。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：转化含有经优化的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因表达载体pET-MTG的大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)的菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Branden-MTG-001 CGMCC No.5497。

4.一种提高茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶表达量的方法，是发酵权利要求1或2或3所述茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的工程菌，表达的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶以包涵体的形式存在于菌体细胞中，收集包涵体，对其进行纯化、变性、复性、离子交换层析和真空冷冻干燥后得到茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：发酵上述工程菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.6-1.2mmol/L，优选为0.8mmol/L，诱导温度为35-39℃，优选为37℃，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对包涵体进行纯化包括以下步骤：将所得菌体用pH8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl、1mmol/L EDTA)缓冲液重悬，在低温下匀浆破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，将沉淀部分(包涵体)用含有TritonX-100的pH 8.0的20mmol/L Tris-HCl(0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％TritonX-100)缓冲液洗涤三次，然后再用适量的pH 8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液处理三次。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对包涵体进行变性、复性包括以下步骤：将经洗涤纯化的包涵体(蛋白浓度约为20mg/mL)溶于pH8.0的20mmol/LTris-HCl(0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，100mmol/L β-巯基乙醇)缓冲液中进行变性，室温搅拌过夜，离心去除沉淀后，将上清液用pH8.0的50mmol/L Tris-HCl(0.3mmol/L GSSG、3mmol/L GSH、1mmol/L的DTT、2mmol/L的尿素、50mmol/L甘氨酸、0.05％的TritonX-100)缓冲液稀释50倍，4℃搅拌过夜，导致包涵体复性。用0.5mol/L的醋酸调pH值至6.0，离心去除沉淀。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对复性产物进行纯化的方法为强阳离子交换层析法。