[发明专利]一种ERα36敲低PC12细胞株及其构建方法无效
| 申请号： | 201110456851.3 | 申请日： | 2011-12-30 |
| 公开（公告）号： | CN102533765A | 公开（公告）日： | 2012-07-04 |
| 发明（设计）人： | 邹伟;马依妮;徐祎慧 | 申请（专利权）人： | 辽宁师范大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10;C12R1/91 |
| 代理公司： | 大连东方专利代理有限责任公司 21212 | 代理人： | 贾汉生 |
| 地址： | 116029 *** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 er 36 pc12 细胞株 及其 构建 方法 | ||
1.一种ERα36敲低PC12细胞株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(a)构建含有碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的pRNAT-U6.1/Neo重组质粒；
(b)利用如步骤(a)获得的重组质粒转染宿主细胞PC12得到重组细胞株；
(c)将步骤(b)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选10～14天，获得阳性细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15％新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL；
(d)在15％NCS的RPMI1640培养基中加入G418的终浓度为250μg/mL，在37℃的5％CO2培养箱中维持筛选，每3～5天更换上述培养基；
(e)将步骤(d)筛选所得的阳性细胞株利用免疫细胞荧光、Western Blot方法、免疫细胞化学法检测ERα36的表达；
其检测结果为：与PC12细胞株相比，阳性细胞株中有98％以上的细胞表达绿色荧光蛋白，阳性细胞株中ERα36的表达量为PC12细胞的47％。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(a)所述的构建方法包括如下步骤：
(f)取SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2两条单链DNA模板等浓度混匀后，经95℃加热10min，室温静置1h，稀释至终浓度10ng/ul；
(g)用T4DNA连接酶将步骤(f)所得产物与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体pRNAT-U6.1/Neo在22℃连接2h；
(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E.coli DH5α后，经细胞培养、提取质粒、测序鉴定结果如SEQ ID NO：3。
3.如权利要求1或2所述的构建方法所获得的ERα36敲低PC12细胞株。
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