[发明专利]用原核表达产物处理水稻根组织诱导其产生胼胝质的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用原核表达产物处理水稻根组织诱导其产生胼胝质的方法，具体涉及一种用稻瘟病菌效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织诱导其产生胼胝质的方法，属于植物保护和生物技术领域。

背景技术：

植物与其病原菌共同进化了上百万年，自然选择促使植物产生了各种各样的识别和抗性机制来防止和限制病原菌侵染。植物进化的同时也促使病原菌基因进化以适应或抵抗植物防御反应使其侵染寄主达到致病的最终目的。寄主-病原菌进化的结果使病原菌参与进化的基因多样化，特别是编码病原菌效应蛋白的基因。尽管效应蛋白被认为是对植物致病，但在一些植物品种里，效应蛋白也能被抗性蛋白识别，引发寄主细胞程序化死亡即HR反应。因此，病原菌效应蛋白具有诱导植物致病和防御反应的双重作用。

稻瘟病菌效应蛋白基因PWL1、PWL2、AVR-Pita、ACE1、AVRs、AVR-Pia、AVR-Pii和AVR-Pik/km/kp已经被克隆鉴定，除PWL1、PWL2和ACE1外，其余效应蛋白基因均特异性地与相应抗性基因发生互作。在它们与水稻发生特异性非亲和互作时能快速地引发寄主细胞HR反应。此外，对稻瘟病菌侵染早期的基因也研究得较多，诸如识别疏水信号的MPG1、PTH11基因，进行信号传递的CPKA，MAC1、MAGB，PMK1，MST7和MST11等基因，参与黑色素合成的ALB1、BUF1和RSY1基因，附着胞膨压形成的PTH2基因，侵入栓形成的PLS1、MST12，MPS1、GAS1、PDE1、CYP1等基因。以上涉及到的稻瘟病菌效应蛋白基因大都是稻瘟病菌侵染过程中表达的基因，都是致病基因，也涉及引起寄主细胞HR反应的无毒基因。而很少涉及能够引发水稻基本防御反应产生的效应蛋白基因的报道。我们从预测的分泌蛋白基因中，发现了一个表达产物能够在水稻叶片上引起坏死斑的基因，通过RT-PCR检测，表明其在稻瘟病菌侵染水稻24h时的表达量达到最高，其表达量变化特征表明该基因主要在侵染前期大量表达，能够作为稻瘟病菌侵染前期引发寄主基本防御反应研究的候选基因。

目前，研究病原菌侵染初期引发寄主基本防御反应的方法主要涉及寄主细胞活性氧测定、基本防御反应相关基因表达谱分析和寄主叶片胼胝质产生观察等方法。而对利用病原菌效应蛋白基因的原核表达产物纯化后处理水稻根组织观察胼胝质产生的方法很少见报道。而且观察叶片产生胼胝质时容易受到叶片本身自发荧光的干扰，而植物根组织本身自发荧光较叶片少，对观察根组织产生胼胝质的影响很小。现在还没有一种直接利用基因的原核表达产物体外检测稻瘟病菌效应蛋白诱导寄主根组织产生胼胝质，以快速鉴定效应蛋白基因是否引发寄主基本防御反应的方法的报道。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术之不足，而提供一种快速、简便、准确的用稻瘟病菌效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织诱导其产生胼胝质的方法。

本发明的技术方案是：保持现有原核表达产物表达纯化及胼胝质观察方法不变，包括原核表达技术、蛋白纯化技术、所用荧光显微镜的激发光和发射光波长范围、苯胺蓝染色方法均与常规相同，其特征是用稻瘟病菌效应蛋白基因的原核表达产物，按照1.0mg/ml～10.0mg/ml浓度处理抗病水稻品种日本晴根组织12h后苯胺蓝染色，荧光显微镜直接观察胼胝质形成。

本发明的有益效果在于：

1、方法简便、准确、快速。

2、利用纯化的效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织，通过荧光显微镜观察根组织胼胝质产生，能直接定性地获得水稻基本防御反应产生的情况。

3、苯胺蓝直接对水稻根进行染色，且荧光显微镜观察根组织胼胝质形成时能有效地避免较多自发荧光干扰。

具体实施方案：

实施例一：

1.0mg/ml的融合蛋白处理水稻根组织12h，苯胺蓝染色后直接观察胼胝质形成情况。

将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4℃离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4；200mM NaCl；1mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照1.0mg/ml的浓度处理抗病水稻品种日本晴的根组织12h，苯胺蓝直接染色进行胼胝质观察。对照是将该基因的原核表达产物纯化后按照1.0mg/ml的浓度处理感病水稻品种丽江新团黑谷根组织12h，苯胺蓝直接染色进行胼胝质观察。结果见表1。