[发明专利]一种Bt蛋白Cry70Ba1、其编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的Bt蛋白，具体地说，涉及一种Bt蛋白Cry70Ba1、其编码基因及应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。另外，蚊媒病在预防医学中占有重要位置，其中登革热和黄热病等蚊媒病传播力强、流行面广、发病率高、危害性大。据WHO统计，全世界每年感染登革热人数多达8000万，我国的海南省在1980和1986年曾经暴发过两次登革热，发病分别达到437469例和113589例。登革热和黄热病主要由埃及伊蚊传播。

为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystalproteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(Adang M.J等，Characterized full-length and truncatedplasmid clones of the crystal protein of Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta，Gene，1985，36(3)：289～300.)，人们已经分离克隆了500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N，Zeigler D R，Feitelson J，等Revision of thenomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol    Mol    Biol    Rev，1998，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。一般而言，Cry1、Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治(Kozie，M.G.，Beland，G. L.，Bowman，C.，等Field performance of elite transgenicmaize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillusthuringiensis.Bio/Technology，1993，11：194-200；Perlak，F.J.，Deaton，R.W.，Armstrong，T.A.，等Insect resistant cotton plants.bio/technology，1990；8：939-943；Van Frankenhuyzen，K.，Gringorten，L.，and Gauhier，D.1997.Cry9Ca1 toxin，a Bacillus thuringiensis insecticidal crystalprotein with high activity against the spruce bud worm(Choristoneurafnniferana).Appl.Environ，Microbviol.63：4132-4134；王飞，2001，苏云金芽孢杆菌特异菌株生物学特性及cry9新基因的研究，硕士论文，南开大学)。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治(Goldberg L J，and Margalit J，1977.A bacterialspore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii，Uranotaenia unguiculata，Culex univitattus，Aedes aegypit，and Culexpipiens.Mosqito News，37：355-358)。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性(Wu，D.，Johnson，J.J.，and Federici，B.A.1994.Synergism of mosquitocidal toxicity betweenCytA and CryIVD Proteins using inclusion sproduced from cloned genesof Bacillus thuringiensis.Mol.Microbiol.13：965-972；Wirth，M.C.，Georghiou，G. P.，and Federeci，B.A.1997.CytA enables CryIVendotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIVresistance in the mosquito，Culex quinquefasciatus.Proc.Natl.Acad.Sci.94：10536-10540)