[发明专利]无网格BAC文库的建立方法及该无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法

权利要求书

1.无网格BAC文库的建立方法，其特征在于无网格BAC文库按以下步骤建立：

一、BAC克隆载体的制备；

二、大片段DNA的制备；

三、连接及转化，然后选择含BAC克隆1000～3000个的培养皿，用LB液体培养基或SOB液体培养基进行洗脱，均制成BAC克隆的悬浮液，混合均匀后都等分为2管，一组管为DNA提取筛选管，另一组管为无网格BAC文库管，即实现无网格BAC文库的建立。

2.根据权利要求1所述的无网格BAC文库的建立方法，其特征在于步骤二中大片段DNA片段的平均长度≥70Kb。

3.如权利要求1所述无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法，其特征在于按以下步骤筛选无网格BAC文库以获取阳性克隆：

一、用待筛选序列的特异性引物对BAC文库中的DNA提取筛选管进行PCR，取阳性pool所对应的无网格BAC文库管，并吸取200μL菌液，进行梯度稀释；

二、将步骤一制备的梯度稀释液振荡培养；

三、将步骤二振荡培养的菌液取出一部分进行离心，弃去上清液后用沉淀的菌体离心进行PCR，选取滴度最大的菌液进行涂板，然后，一次用牙签钝端挑取8～15个克隆放入96孔板或384孔板中振荡培养，取少量振荡培养物再次进行PCR反应，将阳性克隆pool进行再次涂板，选取单个克隆进行验证，即可获得单个阳性克隆。

4.根据权利要求3所述的无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法，其特征在于步骤二中振荡培养时间为10～12小时。

5.根据权利要求4所述的无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法，其特征在于步骤二中置于转速为200r/min、温度为37度环境中振荡培养。