[发明专利]一种含金纹细蛾几丁质酶基因重组质粒的构建和应用

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，涉及一种新的金纹细蛾几丁质酶基因LrCHI，涉及昆虫几丁质酶基因的重组原核载体的构建和应用。并且涉及到金纹细蛾几丁质酶基因的克隆方法、重组质粒构建过程以及LrCHI对真菌生长的抑制研究。

背景技术：

几丁质(chitin)又称甲壳素、壳多糖，是通过β-1，4-糖苷键连接成不分支的N-乙酞氨基葡萄糖胺的同聚物，它是自然界中许多生物的结构性组分，主要存在于无脊椎动物、藻类、真菌等生物体中。昆虫几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成成分，在昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质。昆虫几丁质酶是一种参与昆虫几丁质代谢的重要内切型蛋白酶，它通过破坏几丁质的β-1，4-糖苷键初步将几丁质降解成低分子量的寡聚物。昆虫的几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫(如蜜蜂)的毒腺中，在昆虫的消化、变态、侵染等生理活动中的发挥着重要的作用。

在昆虫的整个生命周期中，往往不只表达一种几丁质酶基因，有的多达18种几丁质酶类似基因。不同的几丁质酶基因在昆虫不同的生命阶段发挥着相应的功能。利用southern杂交、RT-PCR等技术对多种昆虫几丁质酶基因的时空表达进行系统研究，结果表明I型几丁质酶基因在昆虫整个生长发育阶段都有一定水平的表达，是昆虫体内最重要、最基本一种几丁质酶。I型几丁质酶基因也是目前研究得最为深入、广泛的一类几丁质酶基因，迄今为止，已从鳞翅目、双翅目、鞘翅目昆虫中发现并报道了50余种I型几丁质酶基因。昆虫I型几丁质酶的分子量在45～85kD之间，酶的活性范围在pH 4.0～8.0之间，等电点在5.0～7.0之间，大多属于18家族几丁质酶，其蛋白质由4个结构域组成：N端信号肽、催化区、连接区和几丁质结合区，在催化区和结合区各有一段保守氨基酸序列，是克隆基因时设计引物的重要依据。不同种类的昆虫其I型几丁质酶基因的结构特点基本相同，以最先发现的烟草天蛾I型几丁质酶基因为例说明：该基因全长2452bp，包含一个1662bp的开放阅读框，编码554个氨基酸，由烟草天蛾基因组中的11个外显子和9个内含子转录而来。

由于昆虫几丁质酶在昆虫各项生理活动中的重要作用，将其纳入到害虫防治上成为近几年各国学者的研究热点。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种被广泛认可和使用的微生物杀虫剂，Arora等报道，几丁质酶Chi36的加入使得Bt对斜纹夜蛾幼虫的半致死浓度降低了30％；杆状病毒是昆虫专一性的病原微生物，在农业害虫的防治中有很大的应用前景，范晓军等用重组有东亚钳蝎昆虫神经毒素基因和烟草天蛾几丁质酶基因的双价重组苜蓿银纹夜蛾杆状病毒和野生型杆状病毒分别感染中国棉铃虫，结果表明重组病毒的半致死浓度比野生型病毒明显减小；昆虫几丁质酶基因在转基因植物中的组成型表达也获得了较好的防治害虫效果，Gatehous等将昆虫几丁质酶基因转入马铃薯中表达，获得的转基因马铃薯增强了对蚜虫的抗性。Ding等对来源于烟草天蛾、细菌、放线菌和植物的4种几丁质酶转基因烟草进行试验，均以1％～2％的浓度加入到新生的甲虫幼虫食物中，结果发现来源于细菌和植物的几丁质酶转基因烟草对幼虫的成活率及生长情况没有产生明显的影响，而取食了含昆虫几丁质酶转基因烟草食物的幼虫在卵孵化后的几天内死亡。这说明昆虫几丁质酶对增强植物抗虫效果更为有效。张宏斌等人分别在家蚕和棉铃虫体内提取几丁质酶，在其最适条件下，和酵母、青霉菌一起在LB固体培养基上培养，抑菌圈实验表明几丁质酶对这种真菌的生长有明显抑制作用。这些研究表明昆虫几丁质酶对害虫和真菌的抑制的确有一定的效果。

昆虫和一些病原真菌的外壳作为物理化学屏障来抵抗不良环境和捕食者，其主要由几丁质和蛋白质组成，将昆虫几丁质酶应用于害虫防治和真菌防治中，利用几丁质酶来分解昆虫的外壳、真菌细胞壁等含几丁质的组织来抑制其正常的生理活动，是一种安全、有效、可行的新型生物防治策略。

发明内容：

本发明提供一种LrCHI基因克隆和重组原核表达质粒pRSET-LrCHI的构建方法，LrCHI为金纹细蛾几丁质酶基因。

本发明克隆得到的金纹细蛾几丁质酶基因LrCHI是一种未知基因，其开放阅读框由1737bp组成，编码578个氨基酸，预测分子量为64.4kDa，等电点pI为5.49，其序列是SEQ ID NO：1，应用NCBI上的Blast进行同源性分析，结果显示与鳞翅目昆虫几丁质酶基因序列之间同源性较高，均超过75％。该基因为本发明人首次发现并报道，同时也是金纹细蛾的首个报道的基因。