[实用新型]鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因TLR15基因SNP分型试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型属于生物技术领域，利用PCR-SSCP技术检测提供一种对鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因Toll样受体15（TLR15） SNP分型的试剂盒。

背景技术

Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）家族被认为是目前哺乳动物和脊椎动物唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白(Gordon, 2002; Nerren et al., 2009)，从源头为疾病机制的研究提供了方向，成为目前研究禽类抗病力的热门基因。ChTLR15 是在2006 年发现的一个鸡所特有的新的TLR类型，相关研究报道沙门氏菌敏感鸡的ChTLR15 的表达水平低于不易感鸡的表达水平，说明ChTLR15是决定鸡是否是对沙门氏菌易感的一个重要因素，而它作为易感性评价的基础就是其SNP特性。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），是由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，包括转换、颠换、插入或缺失。SNP是疾病易感性、显现性、抵抗力、以及药物反应性等生物性状差异的重要基础，很多疾病与基因突变或基因多态有关。SNP作为第三代遗传标记已得到飞速发展，目前已经多种发展成熟的检测技术，如DNA测序（Sanger测序法和焦磷酸测序法）、单链构象多态性（SSCP）、限制性酶切片段长度多态性（RFLP）、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交（ASO）、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及Taqman探针等技术手段。经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见有chTLR15基因多态性位点与肠炎沙门氏菌病抗性相关性的报道。

实用新型内容

本发明的目的是为了给鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因TLR15基因C726T-SNP的检测提供一种准确性高、快速、价格低廉的基因分型试剂盒。

本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，一种鸡肠炎沙门氏菌病抗性相关基因TLR15基因SNP分型试剂盒，其特征是所述的试剂盒由盒体，盒体内的衬垫，衬垫的各孔腔内分别置入的特异性引物混合物TLR15P，DNA Tag 酶，扩增缓冲液，dNTP，10%非变性聚丙烯酰胺凝胶和甲酰胺加样缓冲液组成。

其中TLR15P详细信息如下：

引物混合物TLR15P表示用于TLR15基因PCR扩增的上下游引物混合物，引物信息如下：

上游引物  5'-TTAGCAGCCACGCTGAGG- 3'，

下游引物  5'-GGGCTTCAACGTCTATGTTG- 3' 。

本试剂盒使用方法：

1、PCR扩增SNP位点所在片段

1）PCR扩增反应体系准备

在200 μl 的PCR薄壁管中，加入1μl模板DNA（约50 ng ）、2μl扩增缓冲液(10×buffer)、0.8μl 2.5mM dNTP、0.8μl引物TLR15P (5uM)、0.1μl 5U/ul DNA聚合酶（rTaq）和15.3μl水，PCR的反应体系为20μl，充分混匀后短暂离心。

2）PCR扩增反应程序设置

在eppendorf PCR仪上设置PCR的反应条件为：94℃预变性4 min，后94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸6 min，4℃保存备用。程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。

3）反应结束后，取4μl反应产物在2％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测反应是否成功。

2、SSCP跑胶并鉴定基因型

在200 μl 的PCR薄壁管中，加入4ul第一步所得PCR产物、8ul甲酰胺加样缓冲液，于98℃变性10min，然后迅速冰浴10min后，在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr：Bis=39：1），1×TBE条件下电泳，室温下，先用220V电泳20分钟，便于单链DNA初步分离，再用120V电泳12-14h，银染显色。根据电泳图谱，鉴定基因型。

本实用新型由TLR15基因PCR扩增的上下游引物混合物P、DNA Tag 酶、扩增缓冲液、dNTP、10%非变性聚丙烯酰胺凝胶和甲酰胺加样缓冲液组成，利用PCR-SSCP技术检测基因的基因型，具有准确性高、快速、价格低廉的优点。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图；

图2 TLR15基因PCR产物SSCP分型图；