[实用新型]肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种三探针实时荧光定量RT-PCR检测患儿粪便、咽式子、血液、脑脊液等样本中肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒 A16型(CA16)分型及定量的新方法。本品以肠道病毒高度保守的5’非编码区(UTR)为靶序列，设计肠道病毒通用引物和肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒 A16型三色荧光标记探针，利用一步法三色实时荧光定量RT-PCR 技术,达到早期、快速、准确检测所有肠道病毒及分型的应用目的。 

背景技术

手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患儿可出现中枢神经、呼吸系统损害，引发脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus) A组16、4、5、7、9、10 型， B组2、5型；埃可病毒（ECHO viruses）和肠道病毒71型（EV 71）等均能引起手足口病。其中以EV 71及Cox Al6型最为常见。二者所致的手足口病临床难以区别。与CA16不同，EV71不仅引起手足口病，而且可引起严重中枢神经系统并发症，如脑炎、脑膜炎、急性迟缓性瘫痪等，重者死亡。 

肠道病毒引起的手足口病、病毒性脑炎等疾病潜伏期一般为3～7天，没有明显的前驱症状，多数病人突然起病。早诊断、早治疗至关重要。目前，对于肠道病毒引起的手足口病、病毒性脑炎等疾病实验室仍缺乏快速、敏感、特异的诊断方法。传统的肠道病毒检测有病毒分离培养和血清学诊断，前者曾被视为肠道病毒诊断的“金标准”，但操作繁琐、较为费时，一般需4-15天，且存在操作繁琐、敏感性低，远远不能满足疾病预防的“四早”要求；而血清学诊断最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是常常只能作为回顾性诊断的依据，而且容易与其它病毒产生交叉反应，所以抗体法无助于早期诊断。 

随着分子生物学技术的迅速发展，应用聚合酶链反应技术为病原微生物的检测提供了新的方向，特别近几年兴起的实时荧光定量PCR法。该方法通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算出初始模板量。该法除定量准确、检测快速外，其最大优点是采用完全闭管检测，避免了交叉污染，广泛被科研和临床所接受。 

随着荧光定量PCR检测仪器的更新和染料科学的发展，不同肠道病毒属间的检测可用不同的荧光素标记特异探针，运用多重反转录荧光定量PCR( RT-qPCR)技术，可对临床最常见的肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）同时进行检测；而根据文献报道和对肠道病毒属脊灰病毒、柯萨奇、埃可病毒和肠道病毒68～71型等各型病毒株全基因组分析发现，各型肠道病毒5’非编码区(UTR)存在着高度保守的区域，可以用来设计并扩增检测所有肠道病毒株。从而实现对肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型三联同时检测。 

发明内容

本实用新型的目的是提供一种肠道病毒三联实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒由定量RT-PCR反应液管、标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管和盒体组成，其中定量RT-PCR反应液管装有RT-PCR缓冲液、MgCl₂ 、dNTPs 、EV通用引物、EV通用型荧光探针、EV71型荧光探针、CA16型荧光探针、耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）、反转录酶（PrimeScript RTase酶）。 

检测用引物分上游引物和下游引物： 

上游引物序列为：  5`- CCCTGAATGCGGCTAATCC -3`

下游引物序列为：  5`- GATTGTCACCATAAGCAGCC -3` 

检测用各分型荧光探针序列和各自的荧光素标记物：

EV通用型荧光探针为：   5`FAM--ACACGGACACCCAAAGTAGTCG–3`BHQ-1

EV71型荧光探针为：    5`HEX--CACACGCCCACAAGCCAGC–3`BHQ-1

CA16型荧光探针为：    5`ROX--CACGCACCCTCAACCCAGG–3`BHQ-2

标准品序列为：