[发明专利]猪肌抑素基因启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种猪肌抑素基因启动子及其应用。

背景技术

近十年来，转基因技术得到迅猛发展和广泛应用，尤其是基因打靶与体细胞克隆技术的结合，使得转基因动物的基因定点修饰成为现实。该技术的关键是使外源基因在转基因动物基因组上定点整合并且稳定表达，而外源基因的表达与其启动子的转录活性密切相关。因此，获得具有稳定表达活性的启动子将极大促进转基因动物研究。但目前应用于转基因动物的启动子种类和数量则非常有限，主要是来源于病毒的启动子，如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、猿猴空泡病毒40(simian virus 40,SV40)、单纯疱疹病毒(herpes s implex virus,HSV)等组成型启动子。它们可以在几乎所有种类真核生物细胞内调控外源基因表达，而且没有时空特异性。用上述启动子调控外源基因表达时，由于外源基因在不需要的细胞或不需要的发育阶段大量表达和积累，往往造成动物形态和生理功能异常，以致早衰或死亡。另外，由于它们属于异源基因，容易在转基因动物体内遭受免疫排斥和表观遗传修饰，导致外源基因表达的不稳定性。鉴于此，寻找来源于转基因动物自身的内源性启动子就成为解决该问题的突破口。而且，利用转基因动物内源性启动子的另外一个优势是通过基因打靶，可以实现外源基因的“原位”定点整合，由内源性启动子“原位”驱动，将外源基因的表达控制在一定的生理水平。因此，尽快开展此方面的研究，对于转基因动物的研究和生产具有重要的应用价值。

肌抑素基因最早于1997年由McPherron等人在小鼠中克隆。该基因属于TGF-β家族，是一种转化生长因子。基因敲除证明此基因的失活引起小鼠肌肉组织增生，体重增大；而且小鼠可以正常存活，也具有生育能力。随后在牛、羊等动物中发现，肌抑素基因的主要功能是负调控肌肉生长发育，而且肌抑素的失活并未导致上述动物的生理功能出现异常。因此，肌抑素是迄今为止证明表型效应明显、相对安全的转基因动物候选修饰基因。鉴于肌抑素基因序列和蛋白质序列在物种进化上的高度保守，人们有理由推测猪肌抑素基因也具有相似的功能，因而它正成为目前转基因猪研究的热点基因，潜力巨大。但现阶段研究多着眼于肌抑素基因的敲除以获得产肉率更高的转基因猪，关于猪肌抑素基因启动子的克隆、鉴定和活性分析的研究还是空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪肌抑素基因启动子及其应用。

本发明提供的DNA分子，来源于猪，为如下1）-4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列2所示的DNA分子；

2）序列表的序列3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

4）与1）或2）中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

所述4）所示的DNA分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

所述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

所述重组载体为如下1）或2）：

1）为将所述DNA分子插入pGL3-basic的MluI和BglII位点间得到的重组载体；

2）为将所述DNA分子插入pEGFP-C1的AseI和NheI位点间得到的重组载体。

扩增所述DNA分子的引物对也是本发明保护的范围。

所述引物对为如下1）或2）：

1）所示的引物对中的一条引物的序列为序列5，另一条引物的序列为序列6；

2）所示的引物对中的一条引物的序列为序列7，另一条引物的序列为序列8。

所述DNA分子在使目的基因在离体动物细胞中的表达中的应用也是本发明保护的范围。

所述动物细胞为鼠源细胞或人源细胞。

所述鼠源细胞为小鼠成肌细胞；

所述人源细胞为人宫颈癌细胞。

所述小鼠成肌细胞为C2C12细胞；

所述人宫颈癌细胞为Hela细胞。

除非特别指出或是单独定义,本文所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。另外,本文所述的材料、方法以及实施案例本意在于说明和阐述而非限制或限定。