[发明专利]使用乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白增加光合作用碳固定的方法

说明书

农作物产量受很多因素影响，其中一方面是影响植物生产生物量能力的因素（光合作用，养分和水分的吸收），和另一方面是影响植物抵抗某些压力，例如生物压力（昆虫，真菌，病毒…）或非生物压力（干旱，盐度，营养缺乏...）能力的因素。

影响植物生产生物量的一个重要因子是光合作用。通过光合作用的机理，植物俘获大气二氧化碳并转化为糖，然后纳入植物组织中，从而产生生物量。光合作用是地球上所有初级生产力的最终来源。

大部分植物有光合作用机理，其中叶绿体蛋白质酶RuBisCo（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）是主要的获取二氧化碳和将其转化成糖的酶。那些植物属于所谓的C₃植物，包括一些最重要的农作物，例如水稻、小麦、大麦、马铃薯、油菜籽。C₃植物光合作用机理的一个已知问题是碳固定效率在某些环境条件下不是最佳，其中部分碳固定通过称为氧化的RuBisCo其他活性，而丧失。

RuBisCO能催化核酮糖-1,5-二磷酸的羧化和氧化。两种活性之间的平衡主要取决于植物对某些环境条件反应后改变的叶中CO₂/O₂比率。每个羧化反应生成两分子磷酸甘油酸盐，进入卡尔文循环，最终形成淀粉和蔗糖并产生核酮糖-1,5-二磷酸。氧化反应生成单分子的磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸。后者通过光呼吸作用重新循环为磷酸甘油酸（Leegood R.C.等，1995）。每生成两分子磷酸乙醇酸，释放一分子CO₂，造成碳固定的净损失，最终降低糖和生物量的生成。氨在此反应中也损失，并需要通过叶绿体中能量消耗反应重新固定。

已经报道克服光呼吸作用作为提高光合作用最大效率和增加产量的目标（Zhu等，2008），并且迄今已描述一些尝试来降低植物中碳损失并因此提高糖和生物量生产。

Kebeish等报道阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）中光呼吸作用的损失可通过向叶绿体中引入光呼吸作用中间物乙醇酸分解代谢的细菌通路来缓解（WO 03/100066；Kebeish R.等，2007）。作者首先将大肠杆菌（Escherichia coli）乙醇酸脱氢酶酶的三个亚基靶向阿拉伯芥叶绿体，然后引入大肠杆菌乙醛酸连接酶和大肠杆菌羟基丙二酸半醛还原酶以完成此通路，与内源光呼吸通路平行转化乙醇酸成甘油酸。五个大肠杆菌基因的逐步核转化产生其中叶绿素乙醇酸直接转化为甘油酸的阿拉伯芥植物。这些转基因植物生长更快，生产更多芽和根生物量，并包括可溶性更高的糖。

PCT/EP2009/059843描述水稻植物中增加生物量生产和/或种子生产和/或碳固定的方法，其中水稻植物用大肠杆菌乙醇酸脱氢酶三个亚基（glcD，glcE和glcF）转化，没有后续引入大肠杆菌乙醛酸连接酶和大肠杆菌羟基丙二酸半醛还原酶。

本发明目标是使用细菌多个亚基乙醇酸脱氢酶（GDH）在农作物中的翻译融合，避免耗费时间和多个转化或多个表达盒转化的繁琐过程。细菌（glcD，glcE和glcF）亚基已经与灵活接头以不同配置融合，并在大肠杆菌GDH缺陷株中检测，显示重组GDH多个亚基融合蛋白DEFp，EFDp和FDEp有活性。性能最好的构建体已经转入烟草（Nicotiana tabacum），水稻和油菜籽植物，并且转基因植物显示明显增加的生长和提高的光合作用率。

本发明涉及植物中增加生物量生产和/或种子生产和/或碳固定的方法，所述方法包括向植物细胞基因组引入编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸，其中所述引入所述核酸可从头表达有乙醇酸脱氢酶酶活性的合成多肽，并且其中所述一个多肽定位在所生成植物的叶绿体中。

发明背景中，乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白是由对乙醇酸脱氢酶活性必须的乙醇酸脱氢酶亚基组成的一个多肽，一般在这些亚基之间有肽接头。

本发明中，我们选择适于将细菌glcD，glcE和glcF结构域共价连接成多蛋白形式的重复接头序列（Gly₄Ser）₃，而不干扰所需属性，例如正确折叠，溶解性和GDH活性。另外，接头不应被植物细胞质中的蛋白酶切割，使叶绿体中多蛋白可过量表达。

发明背景中，生物量是由单个植物或植物生长表面积产生的物质量。可以测量几个参数以测定生物量生产的增加。这些参数的示例是植物高度，叶片的表面积，芽干重，根干重，种子数目，种子重量，种子大小…。种子生产或种子产率能在每个单独植物或植物生长的每个表面积测量。