[发明专利]用随机引物和特异性引物的混合物等温扩增核酸

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求保护于2010年2月9日提交的美国专利申请号12/702,884的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

关于联邦政府资助研究与开发的声明

本发明在政府资助下进行，合同号为由国防威胁降低局授予的HDTRA1-07-C-0097。政府拥有本发明某些权利。

发明领域

本发明通常涉及用于等温链置换核酸扩增的方法和试剂盒。所述方法具体涉及用随机引物和特异性引物的混合物等温扩增核酸。

发明背景

目前许多技术用于扩增核酸，甚至从几个分子的起始核酸模板开始扩增。这些技术包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维续序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)或滚环扩增(RCA)。

核酸扩增技术经常用于基于核酸的测定，其用于分析物检测、传感、法医和诊断应用、基因组测序、全基因组扩增等。所述应用常常要求扩增技术具有高特异性、灵敏度、准确性和稳健性。当可用的起始模板核酸为极小量时，核酸扩增尤其重要。然而，大多数目前可利用的核酸扩增技术受到通过产生不需要的/假的扩增产物的非特异性扩增反应而产生的高本底信号的影响。

用等温扩增条件可以以更高的准确性和容易性实现自生物样品的核酸扩增和分析。等温扩增方法相对于热循环方法(例如PCR)的主要优势是通过避开对热循环仪的需要而用最少仪器实施反应的能力。用于等温扩增的仪器可以利用受控的加热块或水浴，使得所述技术更易获得、更方便和更经济。此外，许多等温扩增技术，例如滚环扩增、全基因组扩增或环介导的等温扩增(LAMP)，可以不需要事先纯化靶标核酸，直接用含有靶标核酸的粗生物材料来实施。然而，在某些特定应用中，例如全基因组扩增中，当采用现有扩增方法时，一些特定的目的基因座可在扩增过程中丢失。因此，需要开发设计为保存模板核酸中存在的所有必需序列的更好的等温扩增方法。

简述

本发明的一个或多个实施方案提供了用于有效扩增核酸的方法和试剂盒。在一些实施方案中，提供了在等温条件下利用特异性引物和包含随机序列的引物的核酸扩增方法。

在一个实施方案中，提供了用于核酸扩增的方法。所述方法包括提供核酸模板、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含随机序列的引物和特异性引物。所述方法包括在等温条件下扩增核酸模板以形成扩增的核酸序列。

在用于核酸扩增的方法的另一实施方案中，所述方法包括提供核酸模板、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含随机序列的引物和特异性引物。所述方法包括在等温条件下扩增核酸模板以形成与表面连接的扩增的核酸序列。

在另一实施方案中，提供了用于核酸扩增的试剂盒。所述试剂盒包括Phi29 DNA聚合酶、至少一种包含随机序列的引物和至少一种特异性引物。

附图

当参考附图阅读以下详述时，本发明这些和其它特征、方面和优势将变得更好理解，附图中相似符号在全部附图中代表相似部分，其中：

图1是滚环扩增反应、通过珠粒结合的特异性引物对扩增的脱氧核糖核酸(DNA)的捕获和捕获的DNA的进一步扩增的示意图。

图2是在珠粒上的等温滚环DNA扩增反应示意图，其显示了用随机引物让DNA从一个珠粒转移到另一个珠粒。

图3是显示珠粒结合的DNA与表面结合的引物杂交和表面结合的引物的进一步延伸以在表面捕获DNA拷贝的图。

图4A是用扩增的DNA和捕获的DNA包被的单个珠粒的图像。图4B显示没有任何扩增DNA包被的单个珠粒。

图5是阐明与阴性和阳性对照(泳道3和4)相比的通过珠粒结合的特异性引物捕获的扩增pUC 18 DNA的EcoRI限制性酶消化产物(泳道2)的琼脂糖凝胶图像。

图6是阐明在不同条件下通过珠粒结合的特异性引物捕获的扩增DNA的EcoRI限制性酶消化产物的琼脂糖凝胶图像。

图7是在珠粒上捕获的扩增的DNA (SEQ ID NO: 2)的测序数据图。

详述