[发明专利]L-苏氨酸的分析方法和L-苏氨酸脱氢酶

说明书

本发明提供了包含在被分析物中的L‑苏氨酸的分析方法，将含有被分析物的样品与来源于钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）的L‑苏氨酸脱氢酶以及辅酶NAD⁺混合，经过预定的时间后，分析NADH的量或2‑氨基‑3‑氧代丁酸的量；可用于该分析方法中的新型L‑苏氨酸脱氢酶（TDH；EC 1.1.1.103）——来源于钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）的L‑苏氨酸脱氢酶；用于制备该酶的基因等和酶的制备方法；还提供了包括（A）上述L‑苏氨酸脱氢酶和（B）辅酶NAD⁺的用于分析L‑苏氨酸脱氢酶的试剂盒，其是在缓冲液中含有上述L‑苏氨酸脱氢酶且用于分析L‑苏氨酸脱氢酶的酶制品；使用上述L‑苏氨酸脱氢酶的酶传感器。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年3月4日提交的日本专利申请2010-48193号的优先权，兹将其全文援引到本文中。

技术领域

本发明涉及L-苏氨酸的分析方法和可用于该分析方法中的L-苏氨酸脱氢酶。

背景技术

L-苏氨酸是必需氨基酸，必须从食物中获取。L-苏氨酸对于保持体内的氮平衡是必需的，并促进正常的生长发育。此外，它对于保持心血管、肝脏、中枢神经、肠、免疫系统的功能也有作用。

由于缺乏维生素B12、II型瓜氨酸血症、败血症、氨基酸或氮失衡，可导致血液中的苏氨酸含量不足。此外，素食主义者由于食用缺少苏氨酸含量的谷类，可以导致苏氨酸不足。对于各种疾病或先天性代谢异常的诊断、患者的长期营养补充、氨基酸代谢异常疾病的相关研究等而言，L-苏氨酸的定量是必须的。

已报道过多种L-苏氨酸的定量方法。通过四乙酸铅使苏氨酸变为乙醛，用浓聚硫酸吸收，检测乙醛与对羟基联苯缩合的色素，来测量蛋白质水解产物、明胶、血清中的苏氨酸，可以通过HPLC、质谱、氨基酸分析装置等定量。这些方法存在操作危险，需要多个步骤，使用昂贵的仪器，不适合操作多个样品的大规模筛选方法的问题。

作为酶学手段，有使用苏氨酸脱氨酶（EC 4.2.1.16）的方法。报道了该酶将L-苏氨酸分解为α-酮基丁酸和氨，所生成的α-酮基丁酸变成腙衍生物的方法（非专利文献1）。

一个例子是用过碘酸氧化大鼠血浆中的苏氨酸，用醛脱氢酶（EC1.2.1.5）定量所生成的醛。通过添加D-半乳糖消耗多余的过碘酸（非专利文 献2）。通过醛脱氢酶的作用，乙醛还原NAD⁺，生成NADH⁺，进一步通过使用荧光色素的方法进行定量。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Watanabe K,Itoh N,Tanaka A,Fukui S.Application of animmobilized Escherichia coli cell tube in analysis of L-threonine.Agric.Biol.Chem.（1982）46:119-126

非专利文献2：Nishida T，Kume S,Saito M,Suda M.A specific method for thedetermination of threonine in rat blood plasma using aldehyde dehydrogenase.JBiochem.（1977）81:1085-1090

上述非专利文献1和2的全文记载经特别明示援引到本文中。

发明内容

发明要解决的课题