[发明专利]新的单克隆抗体以及D二聚体的免疫学测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于准确测定稳定化血纤蛋白(特别是人稳定化血纤蛋白)的纤溶酶分解产物(D二聚体)的新的单克隆抗体以及使用该单克隆抗体的免疫学分析方法。

本说明书中的术语“分析”包括判定分析对象物质是否存在的“检测”和对分析对象物质的量或活性进行定量或半定量确定的“测定”。

背景技术

稳定化血纤蛋白的各种蛋白酶分解产物作为临床诊断方法中的诊断标记物有用。例如如图1所示，稳定化血纤蛋白(交联血纤蛋白(cross-linked fibrin))的纤溶酶分解产物(作为别称，例如可总称为“D二聚体”、“D- D二聚体”、“DD/E复合物”、“XDP”)、即，基本单元DD/E单体及其聚合物(DD/E聚合物，例如DXD/YY、YXY/DXXD、DXXY/YXXD)作为弥散性血管内凝血综合征(DIC)的诊断标记物而被广泛使用。

另外，各种蛋白酶也可以分解存在于血液中的血纤蛋白原，例如，通过纤溶酶生成包含D二聚体的构成要素—D结构域、E结构域的片段X、片段Y、片段D1、片段E3等血纤蛋白原分解产物(可总称为FgDP)。

因此，血栓形成患者的血液中可混合存在由于蛋白酶使稳定化血纤蛋白分解而生成的D二聚体、和由于蛋白酶使血纤蛋白原分解而生成的血纤蛋白原分解产物(FgDP)。可将此两者总称为FDP(以上参照图1)。

另外，以往认为血栓形成患者血浆中的D二聚体是分子量约23万的DD/E组分为主成分，但近年来实际了解到：DXD/YY组分、YXY/DXXD组分、DXXY/YXXD组分等的更高分子量的多聚体为主成分(参照非专利文献1)。

近年来，因血栓形成和/或栓塞死亡的基础疾病显示增加倾向，用于检测血栓形成的临床检查日益进步。最初是将使用血纤蛋白原(Fbg)的多克隆抗体来测定血清中血纤蛋白/血纤蛋白原分解产物的FDP测定用于诊断，但在进行脱血纤蛋白原处理时，该操作仍不足够，所以存在显示假高值的问题。

后来，为了解决该问题，人们寻求与FDP的测定平行、不与血纤蛋白原反应、而只测定作为DD/E复合物的稳定化血纤蛋白分解产物(D二聚体)的D二聚体试剂。

例如， D二聚体的测定方法已知有将识别D二聚体的单克隆抗体固定于胶乳颗粒、塑料板等固相上，基于与D二聚体结合的抗原抗体反应的方法，即胶乳凝集法或ELISA法等(专利文献1)。

但是，在基于抗原抗体反应的方法中，目前所使用的与固相结合的单克隆抗体与D二聚体具有反应性，同时对于与D二聚体具有类似结构的片段X和/或片段Y和/或片段D1和/或片段E3也可能具有反应性。如果使用上述单克隆抗体，则与固相结合的单克隆抗体在测定时也与D二聚体以外的片段结合，可能无法准确测定。

另外，人们也公开了用于解决上述问题的以下的方法。但是，以下试剂中所使用的单克隆抗体仍不能说是D二聚体特异性的。例如专利文献2中报道了一种D二聚体测定试剂，该D二聚体测定试剂与DD/E组分的多聚体和DD/E组分的单体反应，但不与X组分、Y组分、D组分、E组分反应，并且对于DD/E组分的四聚体的反应性至少具有10%的对于DD/E组分的反应性。但是专利文献2中具体给出的DD-M1653(保藏号FERM P-19687号)在专利文献3中已经明确是与DD/E组分的多聚体和DD/E组分的单体以及X组分和Y组分反应，但不与D组分和E组分反应，仍不能说是D二聚体特异性的。

专利文献2中并未显示可特异性且准确地测定检样中的D二聚体。专利文献3公开：即使使用上述对D二聚体反应特异性较低的单克隆抗体，通过将含有对D二聚体具有反应性的单克隆抗体的液状试剂、与固定有对D二聚体具有反应性的单克隆抗体的载体或含有该载体的溶液组合而成的D二聚体测定用试剂盒，可更为准确地测定实际的D二聚体的量，但仍无法简便、特异性且准确地测定检样中的D二聚体。

近年来，由于医学的进步、治疗和治疗药物的进步，例如对血栓形成患者等的治疗使用了溶栓剂，如上所述，以被认为在生理环境下不会发生的状态发生纤溶，这样就无法忽视含有片段D的血纤蛋白原分解产物的存在。因此，专利文献4中公开：在检样中存在片段D时，片段D会干扰胶乳凝集反应，使原本的凝集受到抑制，为了避免获得比原本的值更低的值的结果，是预先人为地使过量的片段D共存，以不受来自检样的不确定的片段D的影响，由此可以准确测定D二聚体。但是，只通过1种抗体的反应特异性并不能特异性且准确地测定检样中的D二聚体。