[发明专利]人工分枝菌酸膜

说明书

【相关申请的交叉引用】

本申请要求2010年2月23日提交的美国临时申请系列No.61/307,441，和2010年8月20日提交的美国临时申请系列No.61/375,707的权利，各通过引用以其整体并入本文。

【政府许可证权利的声明】

本发明在由美国健康学会颁发的资金号R01HG005115和5R21HG004145的政府支持下完成。政府在本发明中具有特定权利。

【背景技术】

分枝杆菌属（Mycobacterium），包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），开发了抵抗当代多-药物治疗方案的株。随着由结核分枝杆菌（M.tuberculosis）的感染导致的几乎2百万每年死亡及随着由麻风分枝杆菌（M.leprae）感染衰弱的多于200,000人，有对明白分枝杆菌复原的机理的伴随的需求。这些疾病的存留和致死部分是由于不通透的分枝杆菌属（Mycobacterium）细胞壁。相比大肠埃希氏菌（Escherichia coli）的细胞壁，分枝杆菌属（Mycobacterium）的独特～8nm厚外部细胞箱具有远远更低的对亲水剂的通透性，且在分枝杆菌属（Mycobacterium）的药物和环境抗性中是关键因素。

尽管含有其他成分，分枝杆菌外膜含有30%～40%分枝菌酸。分枝菌酸含有具有不等的长度的2个疏水尾的羧酸头基。见图1例示分枝菌酸。在体内，分枝菌酸通过羧酸基团与肽聚糖或海藻糖共价连接。分枝杆菌膜的显著不通透性导致对亲水溶质通路的需求。此通路由蛋白孔介导。

对与结核分枝杆菌（M.tuberculosis）密切关联的耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）的分枝杆菌细胞-壁中的孔隙蛋白的体内研究导致外膜孔隙耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）孔蛋白A（MspA）的发现。在耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）中，MspA是最丰富的蛋白和形成用于亲水营养的主要通路，以横过外膜。已在分枝杆菌属（Mycobacterium）物种中分离OmpATb，另一蛋白孔，及离子转运子，但在它们的天然的环境中它们的行为尚待探索。

为了研究孔隙的各种性质，该孔隙常常被嵌入膜中。有对开发用于涉及分枝菌酸膜的这些和其他实验的适合的膜的需求。

【发明概述】

本文提供包含分枝菌酸的人工膜，包含该膜的系统，及制造及使用该膜的方法。因此，一些实施方式提供包含分枝菌酸的人工膜。一些实施方式提供由多种分枝菌酸组成的人工膜。一些实施方式提供由多种分枝菌酸和其他脂质的混合物组成的人工膜。其他实施方式提供基本上由多种分枝菌酸和纳米孔组成的人工膜。其他实施方式提供基本上由多种分枝菌酸，其他脂质的混合物，及纳米孔组成的人工膜。

还提供的是包含人工膜的系统，所述人工膜包含在第1液体导电介质和第2液体导电介质之间定位的分枝菌酸。也提供的是包括向系统施加电场的方法。

也提供制备包含分枝菌酸的人工未支持的分支菌膜的方法。一实施方式提供制造包含分枝菌酸的人工未支持的膜的方法，其包括：（a）用一个或更多分枝菌酸-己烷混合物的包被预处理直径约500nm～约500μm的孔及移出己烷以提供干分枝菌酸；（b）将烃溶剂应用于干分枝菌酸，之后是加热以促进烃溶剂掺入以提供分枝菌酸-烃溶剂组合物；（c）在第1液体导电介质和第2液体导电介质之间放置孔；（d）将分枝菌酸-烃溶剂组合物应用于孔，同时监控离子电流通过孔直到孔电阻增加到1TΩ以上，之后是迫使液体导电介质之一从反式侧通过孔以根据需要消除离子电流阻断；及（e）在孔上放置气泡，之后是气泡收缩，其中由孔电阻增加到1TΩ以上指示膜形成，且其中如果纳米孔可在膜内形成，则指示双层膜形成。

【附图说明】

本发明的上述方面和许多伴随优势会变得更容易被同意，如通过参考以下详述结合附图变得更佳明白。

图1显示存在于分枝杆菌外膜的例示分枝菌酸的化学结构。见Annu Rev Biochem 64:29（1995）。

图2显示在添加MspA之后随着离散电流步骤而跨分枝菌酸（MA）膜的导电性的变化。观察的电流步骤与在DPhPC膜中观察到的电流水平无法区别。

图3显示MA膜（N=330）和DPhPC膜（N=205）的破裂电压的计量的直方图，及包括来自几个不同～20μm孔的数据。MA膜经MspA蛋白的插入确认。