[发明专利]适于发酵混合的糖组合物的细胞

说明书

发明领域

本发明涉及适于发酵包含多种C5和/或C6糖的糖组合物(此类组合物在本文中被命名为混合的糖组合物)的细胞。混合的糖组合物可源自木质纤维素材料。本发明还涉及使用混合糖细胞由混合的糖组合物生产发酵产物的方法。

发明背景

作为化石燃料的替代品生产的大部分乙醇目前来自于对玉米淀粉和基于甘蔗的蔗糖的发酵。为了达成生产可更新燃料的宏伟目标，已开发了新的技术，用于将非食物生物质转化成发酵产物，例如乙醇。Saccharomycescerevisiae是乙醇工业中所选择的生物，但是其不能利用生物质原料的半纤维素组分中含有的五碳糖。半纤维素可占生物质的20-30％，其中木糖和阿拉伯糖是最丰富的C5糖。木糖异构酶(XI)的异源表达是使得酵母细胞能够代谢和发酵木糖的一种选择。类似地，细菌基因araA、araB和araD在S.cerevisiae菌株中的表达导致阿拉伯糖的利用和高效的醇发酵。半乳糖是C6糖，其也是通常存在于木质纤维素中的糖，就经济上的原因而言通常其含量(总糖的～4％)不应被忽略。

J.van den Brink et al，Microbiology(2009)155，1340-1350公开了葡萄糖是Saccharomyces cerevisiae偏好的碳源，并且从葡萄糖受限的发酵条件转换为厌氧条件下半乳糖过量的条件后，半乳糖不被消耗。

迄今为止尚无公开在与葡萄糖相同的方法中将葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖转化成发酵产物的方法。

发明内容

本发明的目标是提供能将葡萄糖、木糖和半乳糖和甘露糖(即，四种糖的混合物)转化为发酵产物的细胞。本发明的另一目标是提供能将葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖(即，五种糖的混合物)转化为发酵产物的此类细胞。本发明的进一步的目标是提供稳定的此类上文定义的细胞。本发明的进一步的目标是提供无标记物的此类上文定义的菌株。本发明的进一步的目标是提供这样的方法，其中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖被同时转化为发酵产物。根据本发明实现这些目标的一个或多个。

本发明提供了适于由包含葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖的糖组合物生产一种或多种发酵产物的细胞，其中所述细胞包含2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因或2至15个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶和2至10个拷贝的araA、araB和araD基因，其中这些基因被整合进细胞基因组中。

本发明进一步提供了用于由包含葡萄糖、阿拉伯糖和木糖和任选地半乳糖和/或甘露糖的糖组合物生产一种或多种发酵产物的方法，所述方法包括下述步骤：

a)在下述混合糖细胞的存在下发酵糖组合物，所述混合糖细胞包含2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因和/或2至15个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，其中这些基因被整合进细胞基因组中；和

b)回收发酵产物。

在一种实施方式中，混合物的糖细胞是Saccharomyces属的细胞。在一种实施方式中，混合物的糖细胞是Saccharomyces cerevisiae种。在一种实施方式中，发酵产物是乙醇。

附图说明

图1展示了质粒pPWT006的物理图谱。

图2展示了质粒pPWT018的物理图谱。

图3展示了Southern印迹放射自显影图。用EcoRI和HindIII二者消化野生型菌株CEN.PK113-7D(泳道1)和BIE104A2(泳道2)的染色体DNA。将印迹与特异性的SIT2-探针杂交。

图4展示了质粒pPWT080的物理图谱，其序列在SEQ ID NO：8中给出。

图5展示了在不同培养基上BIE104P1A2在需氧条件下的生长曲线。在YNB 2％半乳糖上预培养菌株BIE104A2P1。生长曲线在2％半乳糖和1％阿拉伯糖上开始，之后是在图中由数字(1)标注的事件：转移至含2％阿拉伯糖作为唯一碳源的YNB上。达到高于1的OD 600后，将培养物转移至具有0.2的起始OD 600的新鲜培养基上。在纯阿拉伯糖培养基上转移三次后，将得到的菌株命名为BIE104P1A2c。

图6展示了在2％阿拉伯糖作为唯一碳源的YNB上，BIE104P1A2c在厌氧条件下的生长曲线。达到高于1的OD 600后，将培养物转移至具有0.2的起始OD 600的新鲜培养基上。若干次转移后，将得到的菌株命名为BIE104P1A2d(＝BIE201)。