[发明专利]重新接种中空纤维生物反应器系统中生长的贴壁细胞的方法

说明书

优先权

本专利申请要求于2010年5月5日提交的临时专利申请61/331,660的优先权，且本专利申请是于2008年3月5日提交的美国专利申请12/042,763的部分接续申请。

背景技术

在多种处理和治疗中，干细胞的使用正受到越来越多的关注。干细胞可被用于修复或替代受损或有缺陷的组织，且具有治疗大范围疾病的广泛的临床应用。

细胞扩增系统可用于使干细胞以及其它类型的细胞(贴壁细胞和非贴壁细胞)生长。在细胞将要生长和分裂前，贴壁细胞需要贴附的表面。而非贴壁细胞在悬浮液中漂浮的同时进行生长和分裂。

细胞扩增系统为生长的细胞提供营养物且移除代谢物，以及供应有助于细胞生长的生理化学环境。细胞扩增系统在本领域是已知的。

生物反应器或细胞生长腔体作为细胞扩增系统的组件在为扩增的细胞提供最优化环境中起到重要作用。在本领域中已知很多类型的生物反应器。生物反应器装置包括培养瓶、转瓶(roller bottle)、振荡瓶(shaker flask)、搅拌槽式反应器(stirred-tank reactor)、气升式反应器(air-lift reactor)和中空纤维生物反应器。

一旦生物反应器中扩增的细胞达到细胞覆盖或期望的细胞数量，则需要收集细胞，且如果期望进一步的细胞生长，则需要将细胞重新接种在相同或不同的生物反应器中。

不管使用何种类型的生物反应器装置，为了收集贴壁细胞，必须首先从细胞生长的表面上移除细胞。为了从生长表面移除贴壁细胞，初始清洗细胞以移除抑制胰蛋白酶的离子(镁、钙)。然后将胰蛋白酶添加至经清洗的细胞以使细胞从表面松落。一旦细胞被松落，则从膜表面移除它们，且通过清洗被移除的细胞或使它们旋转沉淀为细胞团、移除周围的流体且将它们悬浮在新的生长培养基中进行处理以移除胰蛋白酶。

该程序容易在细胞生长在平板上的开放系统(诸如培养瓶)中进行，其中该程序在层流净化罩中进行。但是在使用中空纤维生物反应器的封闭系统中，该系统对大气是封闭的。没有简单的方法来添加流体或从系统中移除流体，且包含在细胞生长所需的生长培养基中的离子由于通过中空纤维的超滤而从细胞生长空间中丢失。因此细胞存活在被稀释的培养基(来自从细胞初始清洗进入系统的添加的流体)、胰蛋白酶(来自用于使细胞从膜松落的胰蛋白酶)、且由于超滤培养基中没有离子(例如钙和镁)围绕的环境中。

这些因素可造成被直接重新接种在中空纤维生物反应器中的收集的贴壁细胞的细胞生长不足。

因此，需要开发新的重新接种的方案以在使用中空纤维生物反应器的细胞扩增系统中使用。

发明内容

本发明涉及用于直接重新接种收集的在中空纤维生物反应器中生长的贴壁细胞的方法，所述中空纤维生物反应器具有内毛细管空间(intracapillary space)和外毛细管空间(extracapillary space)，其中细胞生长空间是内毛细管空间或外毛细管空间中的一种。该方法包括以下步骤：从所述细胞生长空间移除生长培养基；清洗所述细胞以从所述细胞生长空间移除残留的生长培养基；通过将胰蛋白酶添加至所述细胞生长空间，使所述细胞从中空纤维生物反应器的中空纤维上松落；从所述细胞生长空间移除细胞和所有胰蛋白酶；使来自被移除的细胞中的胰蛋白酶失活；以及，将被移除的细胞和胰蛋白酶直接重新接种在中空纤维生物反应器的细胞生长空间中。

本发明还要求了一种制造收集培养基的方法，所述方法通过使用C_hv_h+0v_回路＝c_fv_h+c_cv_c计算培养基中需要的离子和蛋白质的量，且将计算出的量的离子和蛋白质加入培养基中，以在将贴壁细胞直接重新接种在中空纤维生物反应器中使用。

附图说明

图1为在本发明中有用的中空纤维生物反应器的示例图。

图2示出了可被本发明使用的细胞扩增系统的示例图。

图3是在根据本发明完整重新接种的程序之前、过程中及之后的代谢浓度的示图。

具体实施方式

本申请大体涉及用于收集和/或重新接种来自封闭细胞扩增系统的中空纤维细胞生长腔体/生物反应器的贴壁细胞(尤其为间充质干细胞)的无菌方法。封闭系统指该系统没有直接暴露于大气。