[发明专利]针对革兰氏阴性菌例如奈瑟菌属感染或疾病的免疫原性组合物或疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及革兰氏阴性菌免疫原性组合物和疫苗、其制造和此类组合物在医学中的用途领域。更具体而言，它涉及包含革兰氏阴性菌的外膜蛋白的免疫原性组合物，所述外膜蛋白涉及细胞外锌的吸收。此类蛋白质是有希望的抗原，因为它们显示在属于许多不同革兰氏阴性菌物种的菌株之间的高保守性。

背景

革兰氏阴性菌是许多人体病理学的致病因子，并且存在开发针对这些细菌中的许多的有效疫苗的需要。相应地存在鉴定进一步抗原例如外膜蛋白的需要，所述进一步抗原在革兰氏阴性物种内和可能地在其之间是充分保守的，以便此类抗原可以用作疫苗组分。

在脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）的血清群B的情况下，疫苗的开发已由于下述事实被阻碍，因为其与人聚唾液酸化糖蛋白例如神经细胞粘附分子的免疫学相似性，多糖荚膜是弱免疫原性的。用于疫苗生产的策略因此已集中于脑膜炎球菌外膜例如PorA的表面暴露结构，但已被菌株间的主要外膜蛋白的高抗原变异性妨碍。

然而，近来已发现脑膜炎奈瑟菌表达涉及细胞外锌的吸收的外膜蛋白，“TdfI”或“ZnuD”（WO 00/55327的BASB082；脑膜炎奈瑟菌血清群B的测序基因组中的基因座标签NMB0964；此处称为SEQ ID NO. 1）。这是令人惊讶的，因为先前认为锌经由通过孔蛋白的被动扩散跨越外膜，并且这个发现是涉及跨越革兰氏阴性菌外膜的锌吸收的蛋白质的首次发现。

发明概述

本发明人已鉴定了TdfI在来自众多革兰氏阴性菌物种的许多菌株中的同系物。在这些物种之间氨基酸序列的保守性可以反映TdfI在具有低水平的游离锌的环境中锌的主动吸收中的重要性。TdfI及其鉴定的同系物，以及有待鉴定的同系物，代表用于开发针对革兰氏阴性感染的疫苗开发的抗原的有希望的来源。由于在TdfI及其鉴定的同系物中的二级结构中的氨基酸序列保守性，此类疫苗不仅可以赋予针对个别血清型、亚种和菌株的保护，而且可以赋予跨越细菌物种的所有成员、或其他分类学水平的保护。事实上，如实施例中所示，TdfI可以不管血清群诱导针对测试的几乎所有奈瑟菌属菌株的交叉杀菌抗体，支持这种外膜蛋白用作通用的脑膜炎奈瑟菌抗原的潜力。

本发明基于其预测的进一步令人惊讶的发现是涉及细胞外锌吸收的另一种脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白，“TdfH”（WO 00/11182的BASB024；此处称为SEQ ID NO. 50）的鉴定。虽然认为TdfI涉及从细胞外环境中获得游离锌，但看起来TdfH结合非游离的复合锌，例如如实施例中所示与钙防卫蛋白结合的锌。TdfH的同系物已在来自不同革兰氏阴性菌物种的几种菌株中得到鉴定，并且观察到高度的氨基酸序列保守性。因此，与TdfI类似，TdfH及其同系物预期用作用于针对革兰氏阴性感染和疾病的疫苗接种的抗原来源。

依据支持本发明的工作，目前认为脑膜炎奈瑟菌及许多其他革兰氏阴性物种具有用于跨越外膜的锌吸收的主动机制。涉及至少TdfI和TdfH的此类机制可能是必须的，这是由于在宿主中（例如在人体中），尤其是在特定区室例如呼吸道中低水平的游离锌。如实施例中所示，分别地，缺乏TdfI或H的细胞的活力在低游离锌的条件下或当锌与钙防卫蛋白复合时是受损的。旨在将宿主免疫系统靶向表达TdfI或TdfH的革兰氏阴性菌的疫苗接种允许提供针对由此类细菌的感染的有效预防或治疗，并且由于蛋白质的保守性质，此类疫苗可以具有在革兰氏阴性物种内或可能在革兰氏阴性物种之间显著的交叉保护性。由包含基于这些蛋白质之一的抗原的疫苗赋予的保护可以起因于针对所讨论的细菌的杀菌免疫应答，或简单地起因于蛋白质的锌吸收活性的防止。设想包含TdfI和TdfH衍生的抗原从而靶向鉴定的锌吸收机制的疫苗可以是特别有效的。

相应地，本发明提供了免疫原性组合物或疫苗，和方法，用于引起针对表达涉及细胞外锌吸收的外膜蛋白的革兰氏阴性菌的免疫应答，所述外膜蛋白例如TdfI和/或TdfH及其同系物。还提供了用于制备此类组合物或疫苗的方法。

附图简述

图1. 在蛋白质印迹上TdfI的鉴定。（A）在TSB（泳道1）、RPMI（泳道2）和RPMI中生长的tdfI敲除菌株（泳道3）中生长的HB-1。（B）在具有增加量的TSB加入的RPMI中生长的HB-1。（C）在补充有0.5 μM锌（泳道2）或1 μM锌（泳道4）的RPMI（泳道1）中生长的HB-1。（D）在RPMI（泳道1）中生长的HB-1，伴随增加浓度的TPEN（在泳道2-4中分别为0.1、0.5和1 μM）。