[发明专利]褐色中脉3基因特异性标志物在玉米中用于性状基因渗入的用途

说明书

优先权要求

本申请要求2010年5月12日提交的美国临时专利申请流水号61/334,07的关于“USE OF BROWN MIDRIB-3GENE SPECIFIC MARKERS IN MAIZEFOR TRAIT INTROGRESSION”的提交日的权益。

发明领域

一般而言，本公开内容涉及植物育种。提供了用于测定含有褐色中脉3(bm3)突变的植物的接合性(zygosity)的方法。公开内容的方法进一步可用于增强含有BMR的植物系的育种过程。

发明背景

木质素是植物中与碳水化合物，诸如细胞壁中的半纤维素形成交联的通用组分。木质素聚合物在反刍类中降低纤维消化，并且木质化的程度可以与饲料作物消化率(digestibility)成反比。Cherney等(1991)Adv.Agron.46:157-98。含有褐色中脉(BMR)突变的玉蜀黍展现出与显著降低的木质素含量、改变的木质素组成和改善的消化率有关的叶中脉的微红褐色色素沉着。已经在玉米中鉴定出至少四处独立的BMR突变。Kuc等(1968)Phytochemistry 7:1435-6。在与对照玉米相比时，这些突变(称作“bm1、bm2、bm3和bm4”)都展现出降低的木质素含量。bm3突变包括咖啡酸O-甲基转移酶(COMT，例如，GenBank登录号M73235)基因内的插入(bm3-1)、缺失(bm3-2)和插入/缺失(bm3-3)。Morrow等(1997)Mol.Breeding 3:351-7；Vignols等(1995)Plant Cell 7:407-16。

COMT基因控制木质素生物合成中牵涉的酶活性。COMT利用S-腺苷甲硫氨酸(adenylsylmethionine)对咖啡酸进行转甲基化，这导致生成阿魏酸。最终，自阿魏酸生成松柏醇和芥子醇。在存在自由基的情况中松柏醇、阿魏酸和芥子醇的组合导致木质素生成。Bm3突变已经得到表征，并且认为其通过基因灭活抑制咖啡酸的转甲基化。Guillet Claude等(2004)Theor.Appl.Genet.110:126-35;Piquemal等(2002)Plant Physiology 130:1-11;He等(2003)CropSci.43:2240-51;Morrow等(1997)Mol.Breeding 3:351-7;Vignols等(1995)Plant Cell 7:407-16。然而，尚未开发出特异性检测并测试特定植物在bm3基因座处的接合性的快速方法。

发明概述

本文中公开了用于BMR玉米品种(例如，bm3突变体)的基于高通量PCR的分子表征的方法，其可以极大地增强含有BMR的品系的育种过程。公开了用于测定植物组织样品，并且因此制备样品的植物的接合性的方法，其通过测定bm3突变体和野生型COMT等位基因的存在或缺乏进行。如此，提供了基于端点水解探针PCR的接合性测定法(其在本文中称为测定法)，其特异性检测并测试bm3基因座处的接合性状态。公开了利用同一测定法对中bm3突变体和相应的野生型序列特异性的寡核苷酸的双重性(biplex)的测定法。

附图简述

图1包括具有bm3突变的COMT基因和为COMT基因的部分扩增(约1.8kbp)设计的寡核苷酸的图示。

图2包括来自12种bm3系和3种非bm3系(野生型系)的部分COMT基因序列的扩增的描绘。将PCR产物在2%E上显现，然后经由0.8%ECloneWell提取，随后克隆入pCR4载体中。

图3包括来自bm3突变体和野生型COMT基因的共有序列的比对。三处先前描述的缺失/插入突变加下划线。

图4包括COMT基因及对bm3突变和完整的COMT基因特异性的引物的图示。(A)具有点线的COMT基因代表bm3缺失。COMT基因特异性引物在缺失位点内。(B)bm3突变体基因。bm3特异性寡核苷酸在缺失位点侧翼的正向和反向寡核苷酸和探针跨越缺失区的接合中。

图5a和5b包括实时PCR扩增图，其中对具有FAM的bm3(a)和(b)具有VIC(由于实时PCR仪的限制而用Hex替换)的野生型COMT显示相对荧光单位(RFU)。对于bm3和野生型COMT基因两者，从循环22至36观察到指数扩增期。

图6包括使用基于第30个循环时FAM作为等位基因1(纯合bm3)和VIC(由于仪器限制而用Hex替换)作为等位基因2(纯合野生型COMT)的相对荧光单位的等位辨别测定法进行的基因型测定。