[发明专利]人胚胎干细胞的分化

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2010年5月12日提交的美国临时专利申请No.61/333,831的权益，其全文以引用的方式并入本文以满足所有的目的。

技术领域

本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素生成细胞的方法。具体地讲，本发明提供了一种制备表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群的方法，其大于50％的细胞共表达PDX1和NKX6.1。

背景技术

用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。

在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标记物，诸如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX 17。

定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰十二指肠的同源盒基因PDX1。在不存在PDX1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。

据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001(《科学》，第292卷，第1389页，2001年))报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000(《糖尿病》，第49卷，第157页，2000年))报道，衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。

在一个实例中，Hori等人(PNAS 99：16105，2002(《美国国家科学院院刊》，第99卷，第16105页，2002年))公开了用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了与β细胞相似的细胞。

又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003(《美国国家科学院院刊》，第100卷，第998页，2003年))报道，从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。

Micallef等人报道，视黄酸可以调控胚胎干细胞定向形成PDX1阳性胰腺内胚层。胚胎干细胞分化第4天即对应于胚胎的原肠胚形成末期的期间，诱导Pdx1表达最有效的方式是向培养物中加入视黄酸(Diabetes 54：301，2005(《糖尿病》，第54卷，第301页，2005年))。

Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表明，外源Pdx1表达明显增强所得到的分化细胞中胰岛素、促生长素抑制素、葡萄糖激酶、神经元素(neurogenin)3、p48、Pax6和Hnf6基因的表达(Diabetes 53：1030，2004(《糖尿病》，第53卷，第1030页，2004年))。

Skoudy等人报道，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到了最大效应。他们也观察到胰岛素和Pdx1的mRNA表达水平并未受到视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致了Pdx1转录物的水平增加(Biochem.J.379：749，2004(《生物化学杂志》，第379卷，第749页，2004年))。

Shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成PDX1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的PDX1阳性细胞(Genes Cells.2005Jun；10(6)：503-16(《基因到细胞》，2005年6月，第10卷第6期，第503-516页))。

Gordon等人阐明了在没有血清存在而有激活素连同Wnt信号传导抑制剂存在的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导短尾蛋白(brachyury)[阳性]/HNF3β[阳性]内胚层细胞(US 2006/0003446A1)。