[发明专利]包含小肽的细胞培养基

说明书

背景

细胞培养基提供了在受控、人工和体外环境中维持和生长细胞所必需的营养物。细胞培养基的营养配方(nutrient formulation)、pH和重量摩尔渗透压浓度(osmolality)随参数例如细胞类型、细胞密度和使用的培养系统的变化而变化。

培养基制剂已被用于培养许多细胞类型，包括动物、植物和细菌细胞。培养的细胞具有许多用途，包括用于生理过程的研究和有用的生物学物质的产生。此类有用的产物的实例包括多肽，例如单克隆抗体、激素、生长因子、酶和其它目标多肽。此类产物具有许多商业和治疗性应用，并且随着重组DNA技术的出现，可对细胞进行工程改造以产生大量的此类产物。培养的细胞还常规地用于分离、鉴定和生长可被用作载体和/或疫苗的病毒。因此，体外培养细胞的能力不仅对于细胞生理学的研究是重要的，而且对于否则不能以具有成本效益的方法获得的有用物质的产生是必需的。

细胞培养基制剂已良好地公开于文献中，并且许多培养基是商购可得的。在早期细胞培养工作中，培养基制剂基于血液的化学成分和物理化学性质(例如，重量摩尔渗透压浓度、pH等)并且被称为“生理溶液”Ringer,S.,J.Physiol.3:380-393(1980);Waymouth,C.,In:Cellsand Tissues in Culture,第1卷,Academic Press,London,pp.99-142(1965);Waymouth,C.,In Vitro 6:109-127(1970)。然而，在氧/二氧化碳分压以及营养物、维生素和痕量元素的浓度方面，哺乳动物身体的不同组织中的细胞暴露于不同的微环境，因此，不同细胞类型的成功体外培养通常需要使用不同的培养基制剂。细胞培养基的典型组分包括氨基酸、有机和无机盐、维生素、矿物质、痕量金属、糖、脂质和核酸，其类型和量可取决于给定的细胞或组织类型的具体要求而变化。

谷氨酰胺通常用于细胞培养基，因为已显示其为培养的细胞的主要能量来源。在1959年，Eagle显示，哺乳动物细胞培养物的最佳生长所必需的谷氨酰胺的量为其它氨基酸的量的3至10倍。Eagle等人,Science 130:432-37(1959)。然而，谷氨酰胺在水溶液中和在升高的温度下不稳定，形成焦谷氨酸盐和氨，这对某些细胞可具有毒性。Roth等人,In Vitro Cellular&Developmental Biology 24(7):696-98(1988)。因此，通常在即将使用时将谷氨酰胺添加至细胞培养基中。

或者，为了避免有毒物质如焦谷氨酸盐和氨的形成，可在细胞培养基中使用含谷氨酰胺的二肽(例如丙氨酰-谷氨酰胺或甘氨酰-谷氨酰胺)替代谷氨酰胺Roth等人,In Vitro Cellular&Developmental Biology24(7):696-98(1988)。还已使用谷氨酸来替代谷氨酰胺，以减少氨在细胞培养基中的积累，参见Cell Culture Technology for Pharmaceuticaland Cell-Based Therapies,52,Sadettin Ozturk和Wei-Shou Hu eds.,Taylor和Francis Group(2006)。

其它人已提出酰化二肽例如丙氨酰谷酰胺，以使二肽在加热灭菌条件下更稳定。例如，美国专利No.5,534,538描述了用于肠道或胃肠外营养的N-酰基二肽，其中N-酰基二肽在加热灭菌条件下比相应的非酰化的二肽更稳定，并且其中N-酰基有利地在其到达肾脏之前延迟了二肽的断裂。美国专利No.5,534,538还发现，N-酰基丙氨酰谷酰胺是用于细胞培养基的适当的谷氨酰胺来源，与相应的非酰化的二肽(丙氨酰谷酰胺)相似，其为细胞培养基的已知组分(参见上文Roth等人)。美国专利No.5,534,538还描述，N-酰基二肽优于游离二肽，这至少部分因为N-酰基二肽在加热灭菌条件下的增强的稳定性。因此，美国专利No.5,534,538实际上教导，不要使用其中N-末端氨基酸具有游离氨基的二肽。