[发明专利]对可还原聚(酰氨基亚乙基亚胺)的可切割修饰以增强核苷酸递送

说明书

背景技术

基因疗法是治疗目前常规疗法处理的基于遗传的疾病的可行性替代选择。然而，其临床成功受到开发安全和有效的核酸载体的不确定的设计和配制要求的阻碍。最近的研究进展通过载体修饰提高载体安全性和效力，利用聚乙二醇(PEG)和/或细胞特异性靶向配体改变表面电荷和/或组织特异性(1)。聚合非病毒基因载体具有明显优势，因为如果设计谨慎，它们是非免疫原性的，并且易于修饰以表现出多功能特性(2)。非病毒聚阳离子还相对经济有效，易于工业制备，并且可以携带大量治疗性核酸(3,4)。

已测试许多结构上不同的由线性、支化或树突结构组成的聚合物和共聚物用于体外和体内用途的效力和稳定性。聚亚乙基亚胺(polyethylenimine)基因载体(PEI)已进行了最严格地研究，并且是本领域中的标准，因为它们容易地将DNA缩合为核酸/聚阳离子纳米颗粒(人工合成多聚物(polyplex))，以保护核酸免受血清核酸酶降解，并且在体外和体内于许多细胞类型中表现出相对高的转基因递送和表达。不幸的是，由于不可降解的聚阳离子的细胞内积累，PEI常表现出细胞毒性(3,5)。影响聚阳离子电荷密度的增加的PEI分子量和分支与增加的转基因表达相关，但是还与细胞毒性相关。相反地，低分子量PEI表现出与减少的转基因表达相关的减少的细胞毒性(6,7)。正如预测的，当与PEI比较时，可降解的基因载体如聚(酰氨基胺)(SS-PAA)、聚(酰氨基亚乙基亚胺)(poly(amido ethylenimine))(SS-PAEI)和聚(b-氨基酯)家族的设计被证实具有相当或提高的活性以及较少的细胞毒性(8,9,10)。可还原SS-PAEI是PEI家族的合成类似物，但是具有上述优点(11)。最近的综述提供的结果显示超支化的SS-PAA可以将质粒DNA(pDNA)缩合为大小与bPEI25kDa相似的人工合成多聚物，并且鼓励进一步的功能研究(12)。

通常，阳离子人工合成多聚物与血清中发现的净负电荷蛋白相互作用，这在体外和体内常导致颗粒聚集和效力减少(13,14,15)。为了克服这一障碍，采用将聚(乙二醇)(PEG)缀合至聚阳离子，并且研究显示聚乙二醇化通常改善血清存在下的载体功能。然而，以前的研究还清楚显示，增加靶向配体和/或PEG缀合至PEI特别是低分子量(LMW)PEI(~5kDa)，不利地影响人工合成多聚物形成和载体功能(16,17)。

发明内容

为了进一步理解超支化SS-PAEI的设计和更重要的配制以及它们相应的接枝PEG共聚物，合成几种SS-PAEI聚阳离子基因载体，研究改变PEG/聚阳离子wt%对人工合成多聚物形成、大小、表面电荷、形态、血清稳定性以及最终的生物学活性的影响，并且在本文中描述。利用SS-PAEI、p(TETA/CBA)、其聚乙二醇化的对应物、p(TETA/CBA)-g-PEG2k或者分别为10/90和50/50wt/wt%的两种物质的混合物制备复合质粒DNA或siRNA的人工合成多聚物制剂。改变wt/wt%来鉴定容易地改变人工合成多聚物组成的合适策略以及鉴定易于合成的合适制剂。

本发明的示例性组合物包含聚(TETA/CBA)与聚乙二醇的接枝共聚物。

本发明的另一示例性实施方案包括复合物，所述复合物包含核酸以及聚(TETA/CBA)与聚乙二醇的接枝共聚物。例如，所述核酸可以包含质粒DNA或siRNA。所述复合物还可以包含与所述接枝共聚物混合的聚(TETA/CBA)。

本发明的另一示例性实施方案包括聚(TETA/CBA)和聚(TETA/CBA)与聚乙二醇的接枝共聚物的混合物。

本发明的另一示例性实施方案包括一种转染细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与复合物接触，所述复合物包含核酸以及聚(TETA/CBA)与聚乙二醇的接枝共聚物。例如，所述核酸可以包括质粒DNA或siRNA。所述复合物还可以包含与所述接枝共聚物混合的聚(TETA/CBA)。

附图说明

方案1示出根据本发明合成p(TETA/CBA)1k和p(TETA/CBA)5k的示意图。

方案2示出根据本发明合成p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k的方案。还示出100wt%p(TETA/CBA)5k、10/90wt%p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k、50/50wt%p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k、100wt%p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k以及SS-PAEI+PEG2k的示意图。

方案3示出根据本发明“一步”合成p(TETA/CBA)-g-PEG2k的方案。