[发明专利]疏水相互作用色谱法

说明书

本文中报道了通过用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液从色谱材料洗脱多肽的纯化包含组氨酸标签的多肽的疏水相互作用色谱法。

发明背景

蛋白质在当今的医疗中发挥重要作用。现有技术中熟知生产重组多肽的表达系统。用于药物应用的多肽主要是在原核细胞例如大肠杆菌，以及真核细胞，例如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、HEK细胞、BHK细胞、细胞等中生产的。

对于人类应用，每种药用物质必须符合不同的标准。为确保生物药剂对人类的安全性，例如，必须去除可导致严重伤害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。为达到监管规格，在制造过程后必须有一个或多个纯化步骤。其中，纯度、通量和产量在确定适当的纯化过程中起重要作用。

不同的方法已经完全建立并广泛用于蛋白质纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和色谱(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱)、离子交换色谱(例如阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式离子交换)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附色谱(例如用苯基-琼脂、aza-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和色谱(例如用Ni(II)和Cu(II)亲和材料)、大小排阻色谱，和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(参见例如Vijayalakshmi，M.A.Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

Mateo，C.等人报道了多组氨酸标记的酶的亲和色谱(J.Chrom.915(2001)97-106)。在WO 02/37100中报道了次氮基三乙酸镍(NI-NTA)树脂的新应用。在WO 2005/035092中报道了纯化组氨酸标记的蛋白质的方法和试剂盒。在WO 98/06739中报道了纯化重组蛋白质的方法。

在WO 94/07912中报道了涉及氨基酸模拟物作为洗脱剂的亲和纯化方法。在US 2004/0152076中用固定化金属亲和色谱分离核酸。在US6,005,082中报道了因子VIII的纯化方法。在US 2007/0037966中报道了因子VII多肽的疏水相互作用色谱纯化。

发明概述

已发现可用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液从疏水相互作用色谱材料中回收包含组氨酸标签的多肽。使用本文报道的方法，可避免包含有机溶剂，例如2-丙醇的回收溶液而不损失选择性和产量。

因此，本文中报道了用于获得或纯化包含组氨酸标签的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

-将包含具有组氨酸标签的多肽的第一溶液应用于疏水相互作用色谱材料，和

-通过应用包含咪唑或咪唑衍生物的第二溶液，从疏水相互作用色谱材料回收包含组氨酸标签的多肽，从而获得或纯化包含组氨酸标签的多肽。

本文中也报道了用于生产包含组氨酸标签的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

-培养包含编码包含组氨酸标签的多肽的核酸的原核或真核细胞，

-从细胞或/和培养基回收包含组氨酸标签的多肽，任选地以包涵体的形式，

-任选地溶解和/或重折叠包含组氨酸标签的多肽，

-用疏水相互作用色谱方法纯化溶解的和/或重折叠的包含组氨酸标签的多肽，从而生产包含组氨酸标签的多肽。

在一个实施方式中疏水相互作用色谱材料包含附着了疏水配体的琼脂糖的基质。在另一个实施方式中配体选自正-、异-或新脂肪族或寡亚烷基乙二醇。在进一步的实施方式中配体选自丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、聚(乙二醇)基和聚(丙二醇)基基团。在进一步的实施方式中配体是苯基配体，并且回收步骤中的第二溶液除了咪唑或咪唑衍生物，还包含2-丙醇。

发明详述

本文中报道了以结合-洗脱模式操作的用于纯化包含组氨酸标签的多肽的可扩展的疏水相互作用色谱方法，其中用包含咪唑或咪唑衍生物，例如组氨酸的溶液从疏水相互作用色谱材料回收多肽。通过使用此洗脱系统，可以避免使用含有有机溶剂例如2-丙醇的洗脱缓冲液，而不损失选择性和产量。