[发明专利]新方法

说明书

发明领域

本发明涉及脂多糖(LPS)的生物合成制备领域。具体地，本发明涉及用于从细菌细胞，诸如通过细菌细胞培养获得的细胞提取LPS的改进的方法和组合物。本发明的这些方法和组合物用于制备LPS、LPS衍生物，并且特别是用于制备3-O-脱酰单磷酰脂质A (3D-MPL)。

背景

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的外部小叶(external leaflet)的主要的表面分子，并且只存在于所述外部小叶中。LPS阻止了血清补体和吞噬细胞产生的细菌的破坏，并且与用于集落(colonisation)的粘附有关。LPS是大小约为10,000道尔顿的一组结构相关的复杂分子，并且由三个共价连接区域组成(如图5所示)：

(i) 在外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)

(ii) 核心寡糖中心区域

(iii) 脂质A - 充当疏水性固定物(anchor)的最里面的区域，其包括运载长链脂肪酸的氨基葡萄糖二糖单元。

发明概述

本发明的一个目的是提供用于提取LPS的组合物和方法，其导致改进的LPS的细菌产率。可以从产生的细菌细胞的量(生物量)计算LPS产率。改进的LPS产率能够使在给定的设备中制备更大量的LPS，或者使用较小设备制备等量的LPS。本发明的另一目的是提供用于提取LPS的方法，其显示出从细菌细胞提取的LPS产率的更大可靠性和/或再现性。本发明的另一目的是提供用于提取LPS的更快的方法。

因此，提供了从革兰氏阴性菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：使用包含水、醇和其它有机溶剂的组合物(LPS提取组合物)从细菌的细胞膜提取LPS。

附图简述

图1在50℃从细胞肉汤培养基101B提取的动力学

图2 来自肉汤培养基101B的再现性数据

图3A：具有0%水的80个实验的提取产率的分布

图3B：具有1%的水的55个实验的提取产率的分布

图4 pH的影响

图5显示了LPS分子的三个共价连接区域：(i) 在外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)；(ii) 核心寡糖中心区域；和(iii) 脂质A

图6显示了突变体明尼苏达沙门氏菌(S. Minnesota)R595产生的截短的LPS，并且指出了相对于全长LPS的截断位置。

具体实施方式

LPS提取的已知技术包括Galanos方法，其涉及用苯酚、氯仿和石油醚的混合物(PCP)提取LPS，然后蒸发氯仿和石油醚，添加丙酮和水以沉淀LPS，并且通过离心或过滤回收LPS(Galanos et al., Eur. J. Biochem. 9: 245 (1969))。Chen方法涉及用氯仿和甲醇的混合物(CM)提取LPS，然后进行一系列的甲醇沉淀步骤。Galanos不适合商业制备LPS，因为其不适于大规模生产，并且使用引起健康和安全担忧的溶剂混合物(例如，苯酚：氯仿：石油醚)。Chen方法产生富含LPS和磷脂的CM相，其通常需要多个沉淀步骤以获得具有足够纯度以用于免疫刺激应用(例如用作疫苗佐剂)的LPS。WO02/078637公开了使用革兰氏阴性菌(特别是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota))的深度粗糙的(deep rough)突变体菌株制备LPS和3D-MPL的方法。WO02/078637的方法显示了从2%变至12%的产率上的显著可变性。需要改进的LPS提取方法。

发明人已经揭示除了醇和其它有机溶剂外，通过在LPS提取步骤中使用水，与其中在LPS提取步骤中不使用水的等效步骤相比，能够得到较高的LPS产率。本发明人已经证明了可以通过使用包含水的提取组合物从革兰氏阴性菌提取脂多糖，其产生更多的LPS，具有更大的可靠性并且经历较短的时间(与缺水的等效组合物相比)，并且没有与其它提取方法相关的某些缺点。除了增加的LPS产率以外，本发明人还揭示了通过在LPS提取组合物(水、醇和有机溶剂)中使用水，能够以比没有水时更大的可靠性并且在较少时间内实现这种较大产率。