[发明专利]含有病毒去活化的生长因子且PDGF与VDGF耗尽的血小板裂解物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明关于血小板衍生物的领域，特别是关于得自人类或动物源血小板的生长因子浓厚液的领域。本发明还关于一种制备这类含有生长因子的血小板裂解物的方法，及其在试管内(in vitro)、活体外(ex vivo)的细胞培养(例如干细胞扩增及分化)的用途、美容或临床的应用，如与骨移植体的组合应用。

背景技术

蛋白体学分析的证据显示，人类血小板包含大量具有重要生理功能的分子，其中又以生长因子(GF)最受瞩目。这些生长因子堆积在血小板的α-颗粒内，主要包括三种血小板衍生的生长因子的异构体(PDGF-AA、-AB及-BB)、血管内皮生长因子(VEGF)、转形生长因子-β(TGF-β1及TGF-β2)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、以及一些类胰岛素生长因子(IGF)。现已根据这些生长因子的治疗标的，将复杂的人类血小板生长因子混合物以单一捐输者(single-donor)血小板凝胶生物材料的形式用于治疗方面的应用，上述血小板凝胶生物材料是通过凝血酶对含血小板的血浆进行活化后得到。

血小板活化通常会使包含在血小板内的生长因子释出，在此同时，凝血酶会使纤维蛋白原转变成纤维蛋白而形成凝胶基质(gel matrix)，这类凝胶基质会将生长因子抓在里面。这项生物材料一般会单独施用或与移植材料(graft materials)共同施用在组织上，故可将含有生长因子的血小板凝胶(platelet gels)用于再生医学(regenerative medicine)，以促进软组织及硬组织的愈合及再生。亦可将从血小板得到的生长因子浓厚液补充在试管内(in vitro)或活体外(ex vivo)的细胞培养的生长培养基中。近来已证明，可能使用富含人类生长因子的血小板释出物来取代胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，而使间质干细胞(mesenchymal stem cells)或造血干细胞(hematopoietic stem cells)在活体外(ex vivo)中扩增。

目前将富含生长因子的血小板释出物应用于干细胞扩增一事倍受瞩目，特别是在公认的新“广效”细胞(即间质干细胞mesenchymal stem cells，MCS)，或造血干细胞(hematopoietic stem cells))扩增中用来作为胎牛血清(FBS)或胎犊血清(fetal calf serum，FCS)的替代品，这些血清普遍被视为普利子蛋白(prion)及病毒的可能传染源，也被视为在病患身上造成免疫问题的原因，这是胎牛血清或胎犊血清中残余的牛蛋白和抗原所造成的。

最近已发展出新的策略，包括在公知表现系统中生产重组血小板生长因子，如将某重组人类个体(Rh)生长因子用于治疗用途。某些国家已核准将基因工程酵母菌所表现的Rh-PDGF-BB用于治疗慢性神经病变型下肢糖尿病性溃疡(chronic neuropathiclower-extremity diabetic ulcers)，不过，要达到临床成效需要施用高剂量的这种单一生长因子数周之久。同样地，TGF-β超级家族中的Rh-骨型态发生蛋白(Rh-bonemorphogenetic proteins，BMP)BMP-2及BMP-7可从中国仓鼠卵巢细胞制得，并已核准用于治疗某些骨折手术。然而，可用的重组生长因子数目仍然非常有限，部分是因为这些生长因子在分离、鉴定、选殖及表现方面的难度所致。进一步言之，血小板衍生的制备物的优点仍比使用单一重组因子要多，这是因为在某些应用中，生长因子的组合可达到优势协同作用(synergistic effect)。

目前数据显示生长因子PDGF及VEGF是直接与异常细胞增殖及/或分化有关(例如可参见Ferrara et al.，Nature Medicine，vol.9，no.6，2003，pp.669-676；以及EuropeanMedical Agency在2010年2月18日刊行的EMA/92326/2010，和FDA于2008年3月27日的通讯“an ongoing safety review of regranex(becaplermin)”)。由于在以PDGF及VEGF个别进行的治疗中，发展中癌症的感受性(susceptibility)增加了，因此要避免将这两种生长因子用于培养干细胞或治疗病患，特别是当该病患已有罹癌风险的时候。

因此，目前确有发展处理人类血小板材料的方法的需要，这些方法是用以制备已定性且具病毒安全性的工业生长因子制备物，特别是其中PDGF及VEGF耗尽的制备物。