[发明专利]丝状真菌宿主菌株和DNA构建体以及它们的使用方法

权利要求书

1.一种丝状真菌宿主细胞表达系统，包含：

a.真菌宿主细胞，所述真菌宿主细胞在其染色体DNA中含有非同源重组(NHR)途径的一个或多个组分中的破坏、缺乏第一可选择功能的第一可选择标记、和可有效赋予第二可选择功能的第二可选择标记；和

b.核酸分子，所述核酸分子含有当引入所述真菌宿主细胞中时给所述第一可选择标记赋予所述第一可选择功能的序列、可有效表达一种或多种目的基因的序列、和与侧接所述染色体可选择标记的序列具有实质同源性的序列；

其中所述同源序列引起同源重组事件，所述同源重组事件导致有功能的第一可选择标记、导致所述第二可选择标记的去除和导致所述目的基因的表达。

2.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述NHR途径的一个或多个组分选自ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4和xrs。

3.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述第一可选择标记和所述第二可选择标记是选自alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟素抗性标记、吡啶硫胺素抗性标记、氯嘧磺隆抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因和胸苷激酶的不同标记。

4.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述真菌宿主细胞来自选自木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、链孢霉属(Neurospora)和裸孢壳属(Emericella)的属。

5.根据权利要求4所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述木霉是里氏木霉(T.reesei)。

6.根据权利要求4所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述曲霉是黑曲霉(A.niger)。

7.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述目的基因选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶及其混合物。

8.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述目的基因选自乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。

9.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述目的基因选自肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原及其片段。

10.一种在根据权利要求1至9中任一项所述的丝状真菌宿主细胞中表达目的基因的方法，所述方法包括将所述核酸分子引入所述丝状真菌宿主细胞中，使所述宿主细胞生长，并选择具有所述第一可选择功能但缺乏所述第二可选择功能的宿主细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括测定所述目的基因的表达。

12.根据权利要求11所述的方法，还包括测定由所述目的基因编码的多肽的生物化学功能。