[发明专利]内源启动子在表达异源蛋白中的用途

权利要求书

1. 一种将编码至少一种异源蛋白的序列整合至细胞的染色体中使得所述至少一种异源蛋白的表达通过内源调节系统来调节的方法，所述方法包括：

a) 将以下物质引入细胞中：(i)至少一种靶向内切核酸酶或编码靶向内切核酸酶的核酸，所述靶向内切核酸酶能结合靶序列并切割编码内源蛋白的靶定染色体序列中的切割位点；和(ii)包含编码所述至少一种异源蛋白的序列的至少一种供体多核苷酸，所述序列与编码2A肽的序列连接以形成异源蛋白编码序列，所述异源蛋白编码序列被与切割位点任一侧有基本序列同一性的上游序列和下游序列侧接；和

(b) 将所述细胞保持在这样的条件下，所述条件使得通过同源性定向的修复过程修复通过靶向内切核酸酶引入靶定染色体序列中的双链断裂，使得所述供体多核苷酸中的所述异源蛋白编码序列符合读框地整合至靶定染色体序列中，从而所述至少一种异源蛋白的表达通过调节内源蛋白表达的内源调节系统来调节。

2. 权利要求1的方法，其中所述靶向内切核酸酶为锌指核酸酶。

3. 权利要求1的方法，其中所述编码2A肽的序列连接至编码异源蛋白的序列的5’或3’。

4. 权利要求1的方法，其中所述异源蛋白编码序列在靶定染色体序列的蛋白编码序列的起始或末尾附近整合。

5. 权利要求1的方法，其中所述至少一种异源蛋白为抗体重链或抗体轻链。

6. 权利要求1的方法，其中所述细胞为人细胞或哺乳动物细胞。

7. 权利要求1的方法，其中所述靶定染色体序列编码肌动蛋白、微管蛋白或核纤层蛋白。

8. 权利要求1的方法，其中所述靶向内切核酸酶为锌指核酸酶，其结合与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7和8的序列有至少约80%序列同一性的序列。

9. 权利要求8的方法，其中所述序列同一性为约85%、90%、95%、99%或100%。

10. 权利要求8的方法，其中所述细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述靶定染色体序列编码肌动蛋白，并且所述锌指核酸酶结合选自SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8的序列。

11. 一种包含编码至少一种异源蛋白的染色体整合序列的细胞，所述编码至少一种异源蛋白的序列与编码内源蛋白的染色体序列符合读框地整合，使得所述至少一种异源蛋白的表达与所述内源蛋白的表达被同等地控制。

12. 权利要求11的细胞，其中编码所述至少一种异源蛋白的序列通过编码2A肽的序列与编码所述内源蛋白的染色体序列连接。

13. 权利要求12的细胞，其中所述内源蛋白和异源蛋白各自作为不连续的实体产生。

14. 权利要求12的细胞，其中编码2A肽的序列连接至编码异源蛋白的序列的5’或3’。

15. 权利要求11的细胞，其中所述编码异源蛋白的序列在内源蛋白编码序列的起始或末尾附近整合。

16. 权利要求11的细胞，其中所述染色体序列编码肌动蛋白、微管蛋白或核纤层蛋白。

17. 权利要求11的细胞，其中所述细胞为人细胞或哺乳动物细胞。

18. 权利要求11的细胞，其中所述细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述染色体序列编码肌动蛋白，并且所述异源蛋白为抗体重链或抗体轻链。

19. 一种供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包含编码至少一种异源蛋白的序列，所述序列与编码2A肽的序列连接以形成异源蛋白编码序列，所述异源蛋白编码序列被与靶细胞的染色体序列中切割位点的任一侧享有基本序列同一性的上游序列和下游序列侧接。

20. 权利要求19的供体多核苷酸，其中所述供体多核苷酸为质粒载体。

21. 权利要求19的供体多核苷酸，其中所述编码2A肽的序列连接至编码异源蛋白的序列的5’或3’。

22. 权利要求19的供体多核苷酸，其中所述染色体序列编码肌动蛋白、微管蛋白或核纤层蛋白。

23. 权利要求19的供体多核苷酸，其中所述靶细胞为人细胞或哺乳动物细胞。