[发明专利]从小体积的外周血产生诱导性多潜能干细胞

权利要求书

1.一种从造血祖细胞生产人iPS细胞的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含造血祖细胞的人外周血细胞的细胞群体；

b)在用于促进所述造血祖细胞扩展的扩展条件下培养所述群体；

c)将表达iPS重编程因子的外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件导入所述扩展的造血祖细胞中；以及

d)将所述扩展的造血祖细胞在不含异种物质的培养物中进行培养，由此从所述造血祖细胞产生人iPS细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞群体是来自一个或多个其细胞没有用从外部施加的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)动员的受试者。

3.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含在最多约10ml体积的血液样品中。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述扩展条件包含含有一种或多种细胞因子的扩展培养基，所述细胞因子包括干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素3(IL-3)，或白细胞介素6(IL-6)。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述扩展条件不包含Notch-1配体。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在步骤b)中的扩展条件包含限定的细胞外基质。

7.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中在步骤b)中的扩展条件不包含基质。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在步骤b)中的条件或在步骤d)中的培养物具有最高7％的氧分压。

9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述重编程因子为Sox、Oct、Nanog、Lin-28、Klf4、C-myc(或L-myc)、SV40大T抗原，或它们的组合。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件具有一个或多个多顺反子盒。

11.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述步骤c)在所述扩展步骤b)的约第3、4、5或6天进行。

12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在所述步骤c)中所述扩展的造血祖细胞的起始数量为约10⁴至约10⁵个。

13.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在步骤d)中的培养物包含限定的细胞外基质。

14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述限定的细胞外基质具有单一类型的细胞外基质肽。

15.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述限定的细胞外基质是人纤连蛋白片段。

16.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在所述步骤中的一个或多个中的培养基是化学限定的培养基。

17.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其进一步包括：e)针对iPS细胞进行选择。

18.一种从外周血样品生产人iPS细胞的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含造血祖细胞的外周血样品，其中所述外周血样品的体积最多为10ml；

b)将表达iPS重编程因子的外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件导入所述造血祖细胞中；以及

c)将所述造血祖细胞在不含异种物质的培养物中进行培养，由此从所述外周血样品产生人iPS细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括在所述步骤b)之前，在用于促进所述造血祖细胞扩展的扩展条件下培养所述造血祖细胞。

20.一种体外细胞培养组合物，其包含含有造血祖细胞和其子代细胞的人外周血细胞的细胞群体、不含异种物质的细胞外基质，和不含异种物质的培养基，其中所述造血祖细胞包含一种或多种表达重编程因子的外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件。