[发明专利]生产异源多聚体蛋白质

权利要求书

1.制备异源多聚体蛋白质的方法，所述异源多聚体蛋白质包含具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽、和具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽，其中第二异源二聚化区域与第一异源二聚化区域相互作用，且其中第一和第二含铰链的多肽通过至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：

(a)培养包含编码第一含铰链的多肽的第一核酸的第一宿主细胞，其中在表达该含铰链的多肽的条件下进行该培养；

(b)培养包含编码第二含铰链的多肽的核酸的第二宿主细胞，其中在表达该含铰链的多肽的条件下进行该培养；

(c)破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜，其中第一和第二宿主细胞已在单个悬浮液中组合在一起；和

(d)回收异源多聚体蛋白质，

其中所述方法不需要添加还原剂。

2.制备异源多聚体蛋白质的方法，所述异源多聚体蛋白质包含具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽、和具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽，其中第二异源二聚化区域与第一异源二聚化区域相互作用，且其中第一和第二含铰链的多肽通过至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：

(a)提供纯化的具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽；

(b)提供纯化的具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽；

(c)将第一和第二含铰链的多肽组合；

(d)在体外在允许该分离的第一含铰链的多肽与第二含铰链的多肽多聚化的条件下，使第一含铰链的多肽与第二含铰链的多肽重折叠；和

(e)回收异源多聚体蛋白质复合物。

3.权利要求1或2的方法，其中第一异源二聚化区域和第二异源二聚化区域在界面相遇，第二异源二聚化区域的界面部分包含突起，所述突起可置入第一异源二聚化区域的界面部分中的腔洞中。

4.权利要求1或2的方法，其中第二异源二聚化区域是包含突起的Fc多肽或第一异源二聚化区域是包含腔洞的Fc多肽，或同时两者。

5.权利要求1或2的方法，其中第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面相遇，其中第二Fc多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一Fc多肽的界面中的腔洞中，其中该腔洞或突起或两者是之前已经被引入到第一和第二Fc多肽的界面中的。

6.权利要求1或2的方法，其中第一异源二聚化区域和第二异源二聚化区域包含亮氨酸拉链。

7.权利要求1或2的方法，其中第一异源二聚化区域和第二异源二聚化区域包含卷曲螺旋。

8.权利要求1或2的方法，其中链间二硫键位于抗体的铰链区。

9.权利要求1或2的方法，其中所述链间二硫键位于铰链区之间。

10.权利要求1或2的方法，其中所述二硫键是分子间的。

11.权利要求1或2的方法，其中所述分子间二硫键位于两个包含免疫球蛋白铰链的多肽链的半胱氨酸之间。

12.权利要求1或2的方法，其中含铰链的多肽包含C_H结构域或其变体。

13.权利要求1或2的方法，其中含铰链的多肽包含Fc区或其变体。

14.权利要求1或2的方法，其中第一含铰链的多肽是抗体重链。

15.权利要求1或2的方法，其中第二含铰链的多肽是抗体重链。

16.权利要求1或2的方法，其中第一含铰链的多肽是与抗体轻链配对的抗体重链。

17.权利要求1或2的方法，其中第二含铰链的多肽是与抗体轻链配对的抗体重链。

18.权利要求16或17的方法，其中含铰链的多肽与抗体轻链多肽配对形成靶标结合臂。

19.权利要求1或2的方法，其中含铰链的多肽包含人C_H2和/或C_H3结构域的至少一部分。

20.权利要求1或2的方法，其中一对含铰链的多肽和轻链多肽是人源化的，或者两对均是人源化的。

21.权利要求1的方法，其中含铰链的多肽和轻链多肽在分开的表达质粒上编码。

22.权利要求1的方法，其中含铰链的多肽和轻链多肽在相同的表达质粒上编码。