[发明专利]细胞培养用一次性器具、细胞培养装置及细胞制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于将有用细胞的分离工序、分离的有用细胞的培养工序及培养的细胞的清洗·浓缩工序全部连贯地进行的细胞培养用一次性器具（disposable set）、细胞培养装置及细胞制备方法。

背景技术

近年来，从患者本人或者提供者的体液、组织采集细胞并通过培养将其扩增、加工而向患部进行移植的治疗的所谓再生医疗·细胞医疗正受到重视。对于再生医疗·细胞医疗而言，在许多情况下，在从由体液、组织采集的细胞群之中分离出被用于治疗的有用细胞后，通过培养实施细胞扩增。培养得到的细胞可向皮肤、骨、软骨、角膜等进行移植，在它们的部分疾病中显示出其安全性和有效性，作为有益于患者的治疗方法，期望得到普及（例如，参照非专利文献1）。

近年来逐渐清楚：在骨髓液、脐带血等中，存在具有能够分化成骨、软骨、肌肉、脂肪等多种细胞的性质的附着性成体干细胞（例如，参照非专利文献2～4）。由于成体干细胞具有能够分化成多种多样的细胞、脏器的能力，因此使成体干细胞效率良好地分离、扩增的方法从再生医疗发展的角度来看是极为重要的。现在，就成体干细胞的分离而言，Ficoll Paque分离法（例如，参照非专利文献5）等密度梯度离心法是主流，但该方法为了将分离液与细胞分开而使用离心分离器，需要反复清洗细胞这样烦杂的操作，进而，伴随着由离心操作所致的对细胞的损害、由开放体系中的操作所致的污染的危险。

另外，分离的成体干细胞被报道在骨髓液的有核细胞中存在频率非常小，对于成人而言在10⁴～10⁶个中存在1个（例如，参照非专利文献5），需要通过培养而使之增殖到治疗所必需的数量。现在，成体干细胞的扩增一般是使用器皿、烧瓶、或者培养袋、培养用盒（cartridge）等，在CO₂培养箱内于37℃的温度环境下进行培养。这种情况下，由于培养基更换、传代操作是人实施，因而每次进行这些操作都要有污染的风险、操作时间。

因此，近年来开发出自动地实施细胞播种、培养基更换等培养操作、几乎不耗费人工的自动培养装置（例如，参照专利文献1～3）。然而，现在的自动培养装置装载的仅是自动地培养所需细胞的功能，而没有装载将所需细胞从体液或者组织分离这样的功能。

另外，使目标细胞增殖到规定数量后，进行胰蛋白酶等酶处理、2价阳离子螯合剂等处理，将细胞从培养容器中剥离，剥离的细胞与这些酶液一起被回收，因此，需要另行进行除去胰蛋白酶等酶、2价阳离子螯合剂的操作。

现在，作为最一般的细胞清洗方法，有离心分离法。本方法是以下方法：通过离心分离操作，使细胞沉淀，除去上清后，加入新的清洗液，将细胞再悬浊，再次进行离心分离操作，通过重复本操作，从而进行细胞的清洗。但是，被指出该操作烦杂、封闭体系中的分离操作不容易等细胞清洗工序中的污染风险。

另外，有使用无纺布等分离材料捕捉培养的细胞并回收清洗后的细胞的方法（例如，参照专利文献4），但是与离心分离法同样，这样的技术是单独使用的，并非能够在1个装置中实施特定细胞的分离、培养、回收。

专利文献

专利文献1：日本特开2004-344128号公报

专利文献2：日本特开2004-089095号公报

专利文献3：日本特开2001-275659号公报

专利文献4：日本特开2008-086235号公报

非专利文献

非专利文献1：Robert Paul Lanza等著,大野典也等监译，“再生医学～从Tissue Engineering的基础到最前端技术~”，株式会社NTS，2002年

非专利文献2：Pliard A.et al.,Controlled Conversion of anImmortilized Mesodermal Progenitor Cell Towards Osteogenic,Chondrogenic,or Adipogenic Pathways.,J.Cell Biol.130(6),pp.1461-72,1995

非专利文献3：Mackay A.M.et al.,Chondrogenic differentiationof cultured human mesenchymal Stem Cells from Marrow,TissueEngineering 4(4),pp.414-428,1998