[发明专利]扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于扩增基因区域的引物组合物，所述基因区域在靶基因内存在多种变异，本发明还涉及使用所述引物组合物扩增靶基因的方法，包含所述引物组合物的PCR扩增试剂盒，以及对靶基因进行基因分型的方法，更特别地涉及能够简单并有效地扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物，以无缺失地完成基因区域的准确扩增，同时满足特异性和敏感性条件下精确地分析大量基因型，使用所述引物组合物扩增靶基因的方法，包含所述引物组合物的PCR扩增试剂盒，以及使用所述引物组合物对靶基因进行基因分型的方法。

另外，本发明涉及一种能够产生扩增产物的引物组合物，当扩增靶基因内存在多种变异的基因区域时，所述扩增产物的序列除了待分析的序列的“基因型可分析序列”之外的序列彼此相同，以减少基于限制性片段质量多态性(RFMP)分析的基因分型所示的峰的数目，并利于基因分型，使用所述引物组合物扩增靶基因的方法，包含所述引物组合物的PCR扩增试剂盒，以及使用所述引物组合物对靶基因进行基因分型的方法。

背景技术

有关风险程度的测量广泛使用活生物体的基因分型，进行初步体检或疾病诊断以提供适当的治疗方法。例如，通过分析受试者特定基因的变异及预测疾病的风险程度，基因分型可提前预防疾病。另外，可进行基因分型以分析生物体内任何传染性病原体（诸如病毒）导致的感染是否抗通过分析病毒的遗传变异的特定治疗药物，并预防传染性病原体对特定治疗药物的反应，例如，对药物的抗性反应，且因此开发为患者定制的治疗方法。

人类基因组的基因图谱完成后，允许基因分型广泛进行疾病风险程度的测量，初步体检或疾病诊断及药物反应的预测，并增加了医疗领域中基因分型的兴趣。然而，应注意的是应分析一些碱基序列信息，且应在同时满足特异性和敏感性条件下准确并有效地进行该分析以清楚地揭示包括人类的活生物体中的基因突变和疾病的关系。

尽管有几种分析核苷酸序列或碱基变异的方法，但基本上使用所述方法前应获得大量基因样品。目前，获得基因样品的最常用方法是使用聚合酶链反应(PCR)方法(下文中称为“PCR”)，该方法使用DNA聚合酶。根据PRC方法，可通过设计能够结合模板的引物扩增基因的所需区域。从基因中选择需要扩增的区域并确定能够与所选区域的3’端序列互补结合的核苷酸序列以设计引物。

然而，很难设计用于靶基因内存在多种变异的基因区域的引物，所述靶基因选作用于基因分型。需要小心处理及足够的时间合成PCR引物。此外，存在由引物的非特异性杂交产生假阳性产物的问题。特别是，如果靶基因内有数十或数百种基因型，更难以精确地扩增靶基因内的所有基因区域，每个基因区域存在多种变异，并在同时满足特异性和敏感性的条件下分析其基因型。例如，已知人乳头瘤病毒(下文中称作“HPV”)具有80多株及大约120个亚型。

如上所述如果靶基因内存在至少几十种基因型，很难设计多个精确用于靶基因内存在多种变异的基因区域的引物。另外，由于未能扩增具有特异性变异的基因区域，它会引起假阴性问题以将目的基因型确定为阴性，或通过上述的引物非特异性杂交引起假阳性问题。随着使用的引物的种类数量增加，假阳性问题变得更加严重。靶基因内存在至少几十种基因型的情况下，根据敏感性和特异性之间的权衡比，很难设计并提供同时满足敏感性和特异性的多个引物以精确地扩增靶基因内存在多种变异的基因区域。

当扩增存在多种变异的基因区域时，普遍使用已知的含有至少一个混合碱基的引物设计方法或混合多个设计的引物的方法。

首先，如果假设A型和B型基因进行如下分析，以这样的方式制备含有至少一个混合碱基的引物，其中使用分别对应于腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)，及鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)的混合碱基设计第三和第十五碱基：

A型基因：5'-ggA ttc ggg ccc gaG tct-3'；及

B型基因：5'-ggC ttc ggg ccc gaA tct-3'。

因此，可设计具有以下序列的引物用于A型和B型基因：

5'-ggM ttc ggg ccc gaR tct-3'(R=A/G,M=A/C)。

然而，如果使用很多混合碱基，引物的Tm值变得更高，且可合成不同于模板核苷酸序列的碱基以产生几种扩增产物，由于使用混合碱基所述产物的核苷酸序列不同于一个模板。因此，使用混合碱基的现有技术不能解决上述PCR产物的假阳性问题。