[发明专利]针对在植物中赋予对2,4-二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体检测方法

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年6月4日提交的美国临时专利申请61/351,593的权益，其公开内容在此通过提述完整并入。

发明背景

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)属于苯氧酸类的除草剂，并且已经在许多单子叶植物作物诸如玉米、小麦、和稻中用于选择性控制阔叶杂草，而对期望的作物植物没有严重损害。2,4-D是一种合成生长素衍生物，其作用为使正常的细胞-激素体内稳态脱调节并阻碍平衡的、受控的生长；然而，这类除草剂的确切作用模式仍未得到完全了解。定草酯(triclopyr)和氟草烟(fluroxypyr)是吡啶基氧乙酸除草剂，它们也充当合成生长素。

这些除草剂对某些植物具有不同的选择性水平(例如双子叶植物比单子叶植物更敏感)。不同植物的差异代谢是对选择性水平变化的一种解释。一般地，植物缓慢代谢2,4-D，因此对2,4-D的植物响应变化可能更有可能通过靶位置处的不同活性解释(WSSA,2002;Herbicide Handbook第8版;Weed Science Society of America;Lawrence,KS第492页)。2,4-D的植物代谢通常经由两阶段机制(通常是羟基化，接着是与氨基酸或葡萄糖缀合)发生(WSSA,2002)。

随着时间推移，用2,4-D攻击的某些微生物群已经形成一种用于降解此异生素的替代途径，这导致2,4-D的完全矿化。除草剂的连续应用选择出能利用该除草剂作为碳源和能源进行生长的微生物，给予它们在土壤中的竞争优势。出于此原因，目前配制的2,4-D具有相对较短的土壤半衰期，并且对后续的作物没有显著的遗留影响。

一种已经对其降解2,4-D的能力进行过广泛研究的生物体是真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)(Streber等；1987;Analysis,cloning,and high-level expression of 2,4-dichlorophenixyacetic monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes eutrophus JMP134.J.Bacteriol.169:2950-2955)。编码矿化途径起始步骤中的酶的基因是tfdA。参见美国专利No.6,153,401和GENBANK登录号M16730。TfdA基因产物经由α-酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2,4-D到二氯苯酚(DCP)的转化(Smejkal等；2001.Substrate specificity of chlorophenoxyalkanoic acid-degrading bacteria is not dependent upon phylogenetically related tfdA gene types.Biol.Fertil.Sols 33:507-513)。DCP相比于2,4-D具有很少的除草剂活性。已经在转基因植物中使用TfdA来在对2,4-D天然敏感的双子叶植物诸如棉和烟草中赋予2,4-D抗性(Streber等；1989.Transgenic tobacco plants expressing a bacterial detoxifying enzyme are resistant to 2,4-D.Bio/Technology7:811-816和美国专利No.5,608,147)。

已经从土壤细菌中分离出编码能够降解2,4-D的酶的大量tfdA型基因，并且将其序列存储于Genbank数据库中。许多tfdA同源物(大于85%氨基酸同一性)与tfdA具有类似的酶特性。然而，存在许多如下的同源物，其与tfdA具有显著较低的同一性(25-50%)，但具有与α-酮戊二酸双加氧酶Fe⁺²双加氧酶有关的特征性残基。因此，这些趋异的双加氧酶的底物特异性是什么并不明显。