[发明专利]分析装置以及分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及进行流量计中的离子（也包含细胞）的定量分析的流式粒子分析方法以及装置。特别涉及具有后分光单元和多通道光检测单元的流式粒子分析方法以及装置。

背景技术

在对流量计中的粒子进行定量分析的装置之一中包括流式细胞仪（flowcytometer）。流式细胞仪是在流量计中流过荧光标识的试样（细胞/粒子），对流量计照射激光来测定从试样发出的散射光或荧光的强度，根据光强度对试样的性质进行定量化的装置。为了通过对细胞表面或细胞内部的特定对象物进行标识来进行目标对象物的定量或者判别细胞的种类，而进行试样的荧光标识。通常，荧光标识不仅通过单染色进行，也通过多重染色进行。图15表示用于检测多重染色的现有的装置结构例。被荧光染色的试样610用鞘液（sheathsolution）620夹着在流量计610内形成将细胞（粒子）逐个排列成一列的试样的流。试样610通过激光650被激励，发生散射光和荧光。荧光通过分色镜660被分割，通过与各个荧光的种类对应的带通滤波器670作为各个荧光而被选择性地检测出。在检测器中使用PMT（Photo-Multiplier Tube：光电倍增管）680等。检测出的光通过电信号处理部640被变换为电信号（电压脉冲）后被数值化，通过专用软件690进行直方图等统计分析。但是，该现有装置中，在想要增加要分析的荧光色数时需要增设滤波器组和检测器，因此装置变得大型、昂贵，存在分色镜导致的荧光强度的衰减增大的问题。另外，在不增加荧光数而想要变更要分析的荧光色的情况下，也存在需要再购买与其匹配的滤波器组的问题。

另外，近年来广泛进行了可以测定钙等细胞内离子的浓度的使用了荧光染料的细胞功能分析。这些荧光染料，已知根据细胞的状态例如PH或温度，荧光的中心波长移位。但是，在上述的现有装置中，可以检测的荧光波长频带受到滤波器限制并且是断续的，因此存在难以检测荧光的中心波长（峰值波长）的移位的问题。

专利文献1、专利文献2公开了考虑到这些问题的装置结构。专利文献1与滴定板读取器（microtiter plate reader）相关，专利文献2与激光显微镜相关，都揭示代替现有装置的滤波器组而使用衍射光栅或棱镜等分光单元，代替各个PMT而使用多联PMT或CCD等多检测器的装置结构。通过该结构，滤波器的再购买或更换等作业减少，抑制了滤波器导致的荧光强度的衰减。另外，在进行多重染色测定的情况下，可以将检测波长频带设定为荧光串扰（crossover）的影响小的频带。而且，由于可以自由地设定检测幅度，因此也能够自由改变灵敏度。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2005-513497

专利文献2：日本特开2003-057555

发明内容

发明要解决的课题

图16示意性地表示3种荧光染料的荧光光谱和检测中使用的波长频带的关系。纵轴700表示荧光强度，横轴705表示波长。曲线710、720、730分别表示3种荧光染料1、2、3的光谱。在此例中，用椭圆包围的区域740中荧光染料3的光谱730具有小峰。现有方式的装置中，根据带通滤波器的特性，假定记号750表示的3个带状的区域为检测波长频带。在这种情况下，最短波长区域的检测波长带包含光谱710的峰、光谱730的小峰、光谱720的峰的左侧的下摆部分，因此可知对3种荧光染料的全部荧光检测出信号。即，3种荧光染料的荧光的分离精度变差。

与之相对，在使用分光器和多检测器的情况下，能够以一个检测器检测出的波长频带770为单位设定任意的频带。例如能够进行记号760表示的3个带状的区域那样的波长频带的设定。能够以仅包含光谱710的峰的方式设定最短波长侧的频带，与现有技术相比，能够以高精度分离各荧光染料的荧光。

但是，在成为使用了衍射光栅那样的分光单元和多检测器的装置结构的情况下，如图16所示，在测定试样前需要预先设定用于检测目标荧光的波长频带。

在专利文献1中公开了使用与试样相同的荧光标识的标准试样取得荧光光谱图像，用户选择重叠的影响少的波长频带的方法。但是，在实际进行试样的测定时，没有评价能够以怎样的精度将目标荧光强度与目标外的荧光强度分离的方法。因此，在应用于流式细胞仪的情况下，用户考虑到在实际试样的测定中再次重复波长频带设定等，实际试样测定中的作业负担变大。

在专利文献2中公开了首先不设定波长频带，而在通过激光显微镜取得图像后由用户选择最佳的波长频带的方法。该方法无法应用于需要实时地进行试样的荧光强度测定的流式细胞仪。