[发明专利]高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及高密度脂蛋白3（以下有时称为“HDL3”）中的胆固醇（HDL3中的胆固醇以下有时称为“HDL3胆固醇”）的定量方法。

背景技术

高密度脂蛋白（HDL）胆固醇与由于从包括动脉硬化壁在内的各组织接收胆固醇而蓄积在细胞内的胆固醇的去除作用有关，因此也被称为胆固醇逆向转运体系。已知其与冠状动脉硬化等动脉硬化疾病成负相关，已知HDL为低值时作为血脂异常病的一种而设定有低值界限，作为动脉硬化的指标有用。

HDL由载脂蛋白和磷脂、胆固醇、中性脂肪构成。HDL分类为比重为d＝1.063～1.210g/mL、进一步d＝1.063～1.125g/mL的HDL2和d＝1.125～1.210g/mL的HDL3的2种组分。根据脂蛋白的分布曲线，在d＝1.125部分确认到凹口，从这里开始比重重的部分为HDL3。此外，还存在根据HDL中的载脂蛋白中的载脂蛋白E含量差，将载脂蛋白E的含量多的HDL作为载脂蛋白E-rich HDL的亚组分的分类法。

已知不仅现有的所有HDL蛋白，而且HDL2和HDL3各亚组分也显示出不同的作用。已知在临床中，由于CETP缺损，HDL无法代谢成LDL、IDL，HDL胆固醇量增加。由于CETP缺损而增加的HDL为HDL2。HDL2被认为具有抗动脉硬化作用。此外，也被认为由于CETP缺损，载脂蛋白E-rich HDL上升，对于Apo-E―richi HDL，其胆固醇去除能强，具有抗血小板作用，被认为是HDL中的有益蛋白。此外，由于肝脂酶活性的降低，HDL3不变化为HDL2，HDL3增加。启示了HDL3的增加导致冠动脉疾病的发病率增加。根据这些倾向，推测分别测定HDL亚组分有助于判断动脉硬化疾病的有无、原因。此外，现在各制造商都在进行基于这些HDL亚组分的作用，阻碍CETP作用，使LDL胆固醇量减少，使HDL胆固醇量增加的治疗药的研发。

确立HDL亚组分的简便的测定方法可能关系着详细的作用的解明、它们的治疗效果。

作为到目前为止已知的HDL亚组分的测定方法，已知有超离心法、高效液相色谱法（HPLC）法、HDL3沉淀法（专利文献1）、NMR法等。

超离心是利用脂蛋白的比重差通过离心进行分级的方法，具有操作需要熟练、花费数日、以及费用也高的缺点。对于冈崎等人的使用HPLC分离HDL2和HDL3的方法，操作需要时间，需要特殊的设备。HDL3沉淀法是通过含有2价金属离子和硫酸葡聚糖的试剂使HDL3以外的物质凝集，通过离心回收上清部分的HDL3，通过自动分析装置进行测定的方法。其也具有操作需要熟练、被测物并且是手动方法而需要被测物的前处理操作、到测定为止需要花费一定的时间等缺点，不通用。此外，NMR法是通过核磁共振测量脂蛋白的粒子数的方法，需要特殊的设备，不常用。

需要说明的是，存在HDL亚组分的分析方法(专利文献2)。可以通过通用自动分析装置测定，使用通过使用表面活性剂阻碍HDL3以外的脂蛋白不受酶的作用的方法，在HDL3反应中，存在目标以外的脂蛋白，在对测定产生影响，或者在未阻碍完全的情况下，有测量到HDL3以外的脂蛋白的可能。

需要发明代替这样的方法、能够简便且更选择性地定量胆固醇量的试剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1 : 日本特开2009-207463号公报

专利文献2 : 日本特开2001-346598号公报。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种不需要复杂的操作即可定量被检测试样中的HDL3的方法。

解决问题的技术手段

本申请发明人经过深入研究，结果发现磷脂酶和鞘磷脂酶作用于脂蛋白，但几乎不作用于HDL3。于是想到，使磷脂酶或鞘磷脂酶作用于被检测试样，消除胆固醇，然后定量残留的HDL3中的胆固醇，从而可以定量被检测试样中的HDL3胆固醇，并实验性地确认了上述想法可以实现，完成了本发明。

即，本发明提供一种高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，其包含使磷脂酶和/或鞘磷脂酶作用于被检测试样，使胆固醇移动至反应体系外的第1工序；和定量残留在反应体系内的胆固醇的第2工序。

发明效果

根据本发明，可以不需要超离心、前处理等复杂的操作，而通过自动分析装置特异性地定量被检测试样中的HDL3胆固醇。此外，也可以根据通过作为现有技术的被测物中HDL总胆固醇定量法而得到的总HDL胆固醇量，计算出HDL3胆固醇量的差，从而定量HDL2胆固醇量。

附图说明