[发明专利]修饰的茎-环寡核苷酸介导的反转录和碱基间隔限制的定量PCR

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年6月14日递交的美国临时专利申请第61/354,683号的权益及来自该申请的优先权，在此通过引用将其内容全部并入本文。

发明领域

本发明涉及检测样品中的靶RNA，包括检测样品中的靶miRNA的方法。

发明背景

微小RNA(miRNA)是作为后生动物中基因表达的重要转录后调控因子发现(Bartel，2004)的小的非编码RNA(通常约22个核苷酸的长度)。虽然在各种生理过程中miRNA的表达是关键的(Harfe，2005；Miska，2005；Carthew，2006；Lindsay，2008)，但是miRNA的调控异常参与许多人类疾病例如癌症(Visone&Croce，2009)、肌肉疾患(Chen等人，2009a)和神经变性(Hebert&De Strooper，2009)的病理学。

近来，发现成熟的miRNA在血液中是非常稳定的，且因此具有作为潜在的人类疾病的非侵入性生物标志的广阔前景(Chen等人，2008；Mitchell等人，2008)。迄今为止，已在许多物种中鉴定到数百种独特的miRNA且这些miRNA中的每一种被预测为调控不同的靶基因(Bartel，2009)。随着通过计算机(in silico)预测和体内验证持续发现了更多的miRNA(Mendes等人，2009)，miRNA表达的表征不仅仍是用于评估miRNA的分布和调控的必要工具而且也是用于鉴定新型生物标志和潜在治疗靶的重要工具。

成熟miRNA可通过直接或间接方法检测。虽然直接检测方法(例如，荧光、比色和基于电学的方法)可将样品测量期间引入的变化最小化，但是这些方法受到测定灵敏度低和miRNA同源物之间区分差的限制(Hunt等人，2009中综述)。

间接检测方法主要包括RNA印迹、微阵列和反转录PCR(RT-PCR)。虽被广泛使用，但是RNA印迹和微阵列都是半定量的且受差的灵敏度的限制并需要大量的起始RNA。虽然微阵列提供miRNA的高通量检测和潜在的绝对定量的能力(Bissels等人，2009)，但是最近的研究表明，相比之下，实时PCR在灵敏度和特异性方面仍较为优越(Chen等人，2009b)。最近对用等温法测量miRNA的尝试已经取得了一些成功但却工作强度大(Cheng等人，2009；Yao等人，2009)。

迄今为止，实时RT-PCR仍是最灵敏和有效的定量RNA物质的方法。基于TaqMan探针的实时RT-PCR已被报道并广泛用于有效且特异性地检测miRNA。然而，由于额外的探针水解步骤，TaqMan测定与用于快速检测miRNA的快速热循环方案不相容。另外，随着通过深度测序(Bar等人，2008；Goff等人，2009)越来越多地鉴定到数以百计的候选miRNA，针对每一种新型miRNA的TaqMan探针的设计不仅成本过高而且在技术上也有挑战性并面临实际困难(Varkonyi-Gasic等人，2007)。

已进行不依赖荧光探针而改善miRNA检测的尝试(Raymond等人，2005；Shi&Chiang，2005；Sharbati-Tehrani等人，2008)，然而，这些测定通常包括多个样品处理步骤(Shi&Chiang，2005)并且受累于有限的动态检测范围(Raymond等人，2005)和/或针对同源miRNA的差的特异性(Raymond等人，2005；Shi&Chiang，2005；Sharbati-Tehrani等人，2008)。这些测定和一些其他TaqMan测定(Varkonyi-Gasic等人，2007；Yang等人，2009)的共同策略是使用通用的或共同的反向PCR引物和/或荧光探针以扩增和检测多种miRNA。在这些测定中，实时PCR的特异性仅通过正向PCR引物实现，这不足以区分许多同源miRNA。此外，尚待确定这些测定是否能够快速、多重且直接地检测miRNA而不需RNA分离。

虽然仍在确定多种基因组中微小RNA的数量，但是不同miRNA的数量被预期为多至几千。因为2006年对RNA干扰(A.Z.Fire&Craig C.Mello)授予了诺贝尔奖，所以对检测miRNA的测定的需求稳步增加。

因此，存在对检测样品中的靶RNA，包括miRNA的替代方法的需要。

发明概述