[发明专利]利用回文序列生产闭合线性DNA

权利要求书

1.一种用于生产闭合线性脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法，包括：

(a)在有至少一种引物存在的条件下、在促进模板的扩增的条件下，使包含至少一种原核端粒酶靶序列的DNA模板接触至少一种DNA聚合酶，其中所述至少一种引物能够特异性地结合于在所述至少一种原核端粒酶靶序列内的回文序列并且能够引发在两个方向上的扩增；以及

(b)在促进闭合线性DNA的生产的条件下使在(a)中产生的扩增DNA接触至少一种原核端粒酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在促进所述模板的扩增的条件下，温育所述DNA模板，所述模板的扩增是借助于复制链的替换并通过另一条链的链替换复制。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是SEQ IDNO:2的phi29或其变体，和/或所述原核端粒酶是SEQ ID NO:15的噬菌体N15TelN或其变体。

4.一种用于扩增脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法，包括：

在有至少一种引物存在的条件下、在促进所述模板的扩增的条件下，使包含至少一种原核端粒酶靶序列的DNA模板接触至少一种DNA聚合酶，所述模板的扩增是借助于复制链的替换并通过另一条链的链替换复制，其中所述至少一种引物能够特异性地结合于在所述至少一种原核端粒酶靶序列内的回文序列并且能够引发在两个方向上的扩增。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过滚环扩增(RCA)来进行所述模板的扩增。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在有单种引物存在的条件下进行所述模板的扩增。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述引物由选自以下的序列组成：

SEQ ID NO:30CGCATATTACCT/CGA/TTAACACAC

SEQ ID NO:31GCGTATAATGGA/GCT/AATTGTGTG

SEQ ID NO:32GCGTATAATGG

SEQ ID NO:33CCATTATACGC

SEQ ID NO:34CACACAATA/TGC/TCCAT

SEQ ID NO:35ATGGA/GCA/TATTGTGTG

SEQ ID NO:36CGCATCATACGACTTTATCCA

SEQ ID NO:37GCGTAGTATGCTGAAATAGGT

SEQ ID NO:38CATATCATACGGCTACAATGTATACC

SEQ ID NO:39GTATAGTATGCCGATGTTACATATGG

SEQ ID NO:40TATATTAA/TAAAA/TT/AAATCAT

SEQ ID NO:41ATATAATT/ATTTT/AA/TTTAGTA。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述扩增DNA包含多联体，所述多联体包含扩增自所述DNA模板的DNA序列的串联单元。

9.根据权利要求8所述的方法，当权利要求8从属于权利要求1至3时，或当权利要求8从属于权利要求5至7，权利要求5至7从属于权利要求1至3时，其中，通过所述原核端粒酶，所述多联体被分解为扩增DNA序列的单一单元。

10.根据权利要求8所述的方法，当权利要求8从属于权利要求4时，或当权利要求8从属于权利要求5至7，权利要求5至7从属于权利要求4时，其中，通过限制性内切核酸酶，所述多联体被分解为扩增DNA序列的单一单元。

11.一种引物，能够特异性地结合于在原核端粒酶靶序列内的回文序列并引发在两个方向上的扩增。

12.根据权利要求11所述的引物，其是长度为6至50个核苷酸的寡核苷酸，可选地包含硫代磷酸酯键。

13.根据权利要求11或12所述的引物，其特异性地结合于所述回文序列的仅一半。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的引物，能够结合于SEQ ID No:25至29的序列的任何一种。