[发明专利]RNA提取用溶液

说明书

技术领域

本发明涉及用于从生物样品提取实质上纯粹的RNA的溶液。

背景技术

写在DNA中的遗传信息以多种多样的组合被转录成RNA，从而生物显示复杂的表型。已经明确RNA通过种类、表达量而对生物的表型起作用，为了进行基因表达分析，从各种生物材料提取纯度高的RNA是重要的。为了实现该目标，到目前为止开发了大量的RNA提取方法。频繁被使用的RNA的分离方法有酚提取、从离液盐(chaotropic salt)溶液的沉淀、和对二氧化硅膜的吸附等。

专利文献1记载了用于RNA的提取的包含2～5M的胍和40～60％的酚的溶液。通过使用该溶液，可以将这以前使用超速离心机且需要2天以上的操作以3小时有效地进行RNA提取。该方法被称为单步法。

专利文献2中作为上述专利文献1所记载的方法的进一步改良，公开了用于从包含RNA、DNA和蛋白质的样品中将这些各成分同时提取而分离的提取溶液。具体地，记载了使用包含0.5～2M的胍的浓度30～50％的酚溶液将RNA提取至水层而分离。

专利文献1和2所记载的溶液，其组成不同，但均可以使用各溶液以同样的操作提取RNA。即，可以通过在各溶液中将生物组织均质化，使用氯仿等疏水性有机溶剂，将该匀浆离心而进行层分离。离心分离后，回收含RNA的最上部的水层，使用醇使RNA沉淀，并洗涤，从而提取RNA。

但是，使用专利文献1和2所记载的溶液和方法分离的RNA中，额外混入(残存)有能通过逆转录-聚合酶链反应分析(RT-PCR)检出的程度的量的基因组DNA，因此存在例如在RT-PCR的情况下丧失RNA的定量性等问题(专利文献3，例如0005段)。因此，为了除去混入的DNA必须将通过这些方法分离的RNA进一步纯化。

用于除去在提取的RNA样品中作为杂质而混入的DNA的一种一般方法是，将RNA样品用脱氧核糖核酸酶(DNase)处理。但是，利用DNase的处理在液层进行的情况下，处理后为了除去DNase，必须再次进行酚/氯仿提取和/或蛋白质的变性。另外，在组合二氧化硅膜柱进行提取的情况下，必须反复进行柱的洗涤操作。通过该利用DNase的处理，DNA的混入减少，但这些劳动增加，而且存在产生RNA的损失，从而RNA的提取量减少这样的问题。

专利文献3中作为不进行DNase处理而避免DNA向RNA样品中混入的方法，公开了在pH值小于4的条件下使用RNA提取试剂的方法。但是，一般已知核酸在酸性下脱嘌呤化而分解，实质上分离未分解的RNA是困难的。另外，酸性下DNA对水层/有机层的溶解平衡偏向于向有机层分配，因此通过在pH值小于4的条件下使用RNA提取试剂可以期待某种程度的抑制基因组DNA混入水相的效果，但完全抑制碱基数小的DNA片段的混入是不可能的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第4843155号

专利文献2：日本特开平5-344886号公报

专利文献3：日本特表2007-532140号公报

发明内容

发明要解决的课题

如上，用于从生物样品提取RNA的现有溶液，在要求定量性的情况下，存在不能提取未混入DNA的实质上纯粹的RNA这样的课题。并且，为了除去混入的DNA，需要DNase处理等附加工序。本发明要解决这些课题，提供用于从生物样品提取实质上纯粹的RNA的溶液。

用于解决课题的方法

本发明者们此次对于现有的RNA提取用溶液的组成进行了研究，特别地发现了酚浓度与防止DNA的混入的效果相关，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下[1]～[9]。

[1]一种溶液，是用于从包含RNA并且至少还包含DNA的生物样品中提取RNA的溶液，其中，包含：

(a)相对于溶液的总量超过50体积％的酚、

(b)相对于溶液的总量为3～10体积％的多元醇、

(c)相对于溶液的总量为0.5～2.0M浓度的胍盐、

(d)相对于溶液的总量为0.1～0.5M浓度的硫氰酸盐、和

(e)用于将溶液的pH值维持在4～6的缓冲剂。

[2]根据[1]所述的溶液，其中，酚浓度相对于溶液的总量为55～65体积％。

[3]根据[1]或[2]所述的溶液，其中，进一步包含用于分离水层的有机溶剂。

[4]根据[1]～[3]的任一项所述的溶液，其中，生物样品是培养细胞的培养液。

[5]根据[1]～[3]的任一项所述的溶液，其中，生物样品是生物的体液成分。