[发明专利]使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增

权利要求书

1.用于扩增模板核酸的方法，

其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增（HDA）反应扩增所述模板核酸，并且

其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被引入到模板核酸中，其中HDA反应是嗜热的HDA（tHDA），其中使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸引物将由切口核酸内切酶识别的序列引入到模板核酸中，并且其中扩增的序列短于400bp。

2.权利要求1的方法，其中包含由切口核酸内切酶识别的序列的所述引物包含不与模板核酸杂交的5’标签序列，并且由切口核酸内切酶识别的序列处于所述标签序列中。

3.前述权利要求任一项的方法，其中模板核酸是双链模板核酸，优选为DNA。

4.前述权利要求任一项的方法，其中解旋酶选自：超家族I解旋酶，例如dda、pcrA、F质粒traI蛋白解旋酶和UvrD；超家族II解旋酶，例如recQ和NS3解旋酶；超家族III解旋酶，例如AAV rep解旋酶；来自于dnaB样超家族的解旋酶，例如T7噬菌体解旋酶；以及来自于rho样超家族的解旋酶。

5.前述权利要求任一项的方法，其中聚合酶选自Bst DNA聚合酶、PyroPhage聚合酶、DisplaceAce聚合酶和Vent(exo-)聚合酶。

6.前述权利要求任一项的方法，其中切口核酸内切酶选自Nb.BsmI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BbvCI、Nt.BspQI和Nt.AlwI。

7.前述权利要求任一项的方法，其中在超过50℃、优选在50℃和70℃之间、更优选在60℃和65℃之间的温度下执行HDA扩增反应。

8.前述权利要求任一项的方法，其还包括初始的热变性步骤。

9.前述权利要求任一项的方法，其还包括检测扩增产物的步骤。

10.权利要求9的方法，其中使用凝胶电泳、嵌入染料或特异性寡核苷酸探针来检测扩增产物。

11.用于扩增核酸的试剂盒，其包含

-切口核酸内切酶，

-解旋酶，和

-DNA聚合酶。

12.权利要求11的试剂盒，其还包含

-缓冲剂，例如Tris，和/或

-dNTP，和/或

-(d)ATP，和/或

-镁盐，例如磷酸镁，和/或

-NaCl，和/或

-KCl。

13.权利要求1至10任一项的方法或权利要求11或12任一项的试剂盒在扩增并任选检测核酸序列中的应用。