[发明专利]使用聚合物材料作为样品载体直接进行PCR的方法

说明书

本发明涉及用于采集核酸扩增反应中使用的核酸样品的方法和器械。本发明特别涉及用于采集法医检定用样品的方法和器械，所述方法和器械可在例如犯罪或事故现场或发生生物污染的场所使用，而且所述方法和器械适用于最少的手动干预。

本说明书中明显为先前公开的文献的列举或讨论不一定被看作是承认该文献为现有技术的一部分或公知常识。

目前，由固体生物样品进行分析用哺乳动物(包括人)DNA的标准实验室制备需要部分或全部的以下处理：

需要以某种方式处理样品，通过某种形式的润湿或应用溶液从而将细胞从所在基质(例如，织物内干燥的血或棉签上的皮肤细胞等)移除。换句话说，通过液体增溶实现样品转移。

必须以某种方式处理样品从而促进DNA与蛋白质、碳水化合物、其他核酸等的细胞基质分离(即需要分离DNA)。

分离的DNA需要清除结合的蛋白质等从而使DNA分析过程能够开始-例如接近DNA聚合酶以在聚合酶链式反应(PCR)中复制DNA，或接近其他DNA扩增过程有关的酶或限制性酶以结合和切割DNA序列(即需要清洁DNA)。

所述制备需要清除抑制剂、DNA酶等的样品(即需要移除抑制DNA分析的化学物质)。

干样品需要溶剂化以将细胞物质溶解到上述任一要进行的反应用溶液中(即要求细胞/DNA在溶液中)。

上述过程要求谨慎操作样品、测量备用试剂的等份等，所有这些通常均需要实验室设备和经培训的专业人员来操作。

因此，通常认为，哺乳动物(包括人)细胞需要在溶液中以用于处理和/或预备性操作，并且需要预处理以制备用于DNA分析。

无需预备步骤对细胞溶液取样直接进行DNA分析反应是可能的，但是此举包括有限的样品类型和/或特别处理以实现DNA分析。已确定唾液可直接放入或稀释到PCR反应中，由此可进行基因组DNA分析。通常显示将血直接放入或稀释到PCR反应中需要特别的缓冲液和酶，以在任何程度成功再现的情况下进行反应。需要处理细胞溶液中的PCR抑制剂，通常经过稀释来处理。组织培养细胞需要从其培养环境中采集且需要在放入PCR反应中之前洗涤除去介质等。

换句话说，通常溶液中的细胞可以直接放入PCR分析装置，只要应用适当的稀释或聚合酶法对分析进行优化。

玻璃表面和材料长期以来被确定为细胞和DNA的亲水性结合表面，并且也是适于引发或容纳PCR反应的表面(例如，“Nanassy等人,Analytical Biochemistry2007,第365卷，第240-245页”显示从未经处理的载玻片(适于PCR)上有效回收基因组DNA)。

WO03/057910涉及一种使用具有未修饰的二氧化硅表面的材料分离DNA和随后在未修饰的二氧化硅存在下扩增的方法。其实施例均表明先进行裂解反应以得到DNA。

WO01/14590记载了一种使用含二氧化硅的磁珠放入DNA目标混合物内并然后用外磁力将结合到二氧化硅基质的DNA从混合物中分离出来的方法。其实施例显示通过之前的细胞裂解步骤使得DNA可用于二氧化硅。

还没有特别研制出接触湿或干的样品而无需预处理即可通过接触直接将细胞从来源转移到PCR反应中的玻璃取样装置。迄今为止也还没有制备出利用玻璃的已知性能通过将细胞/DNA应用到例如干/固体表面来将其直接转移到DNA/RNA扩增反应中以采集和转移细胞/DNA的取样装置。

已经考察了使用其他固体表面来捕集适于DNA/RNA扩增分析的细胞和DNA，并且已知由此提供微生物培养物，其中可直接接触(例如用木制牙签)所述微生物培养物中的细菌菌落且无需任何处理(对于质粒和基因组)而将细菌细胞转移到PCR反应中。

粘性表面(例如邮票)，舔(lick)一下即可结合细胞。粘性材料不适于直接放入PCR反应中且必须先处理以溶解掉粘性物质(例如，在提取DNA前用二甲苯预处理所述邮票)。EP1972688提供一种扩增来自微生物的核酸的方法，包括在低pH值(3.00-6.00)下使用固体表面，洗涤所述表面以移除未结合的物质，然后在相同的容器内通过系列步骤将所述表面用于PCR。WO2006/036243和WO2006/036246教导了使用材料来结合细胞溶液以使核酸经随后的处理后适于随后的释放以用于分析。优选的固相支撑材料使用季鎓核酸结合部分。