[发明专利]作用在离子通道上的化合物的筛选用材料及其应用

说明书

技术领域

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年6月29日提交的日本专利申请No.2010-147255的优先权，所述专利申请的内容通过参考结合于此。

本发明涉及作用在离子通道上的化合物的筛选用材料及其应用，更具体地，本发明涉及可用于筛选作用在离子通道（包括膜转运蛋白）上的化合物的含细胞材料以及使用所述材料的筛选方法。

背景技术

离子通道在生理学上具有重要功能。通过靶向这些离子通道发现作用在离子通道上的激动剂和抑制剂有望提供有用的药物。用于评价靶向这种离子通道例如电压依赖性离子通道的药物的筛选系统的方法的已知实例是荧光膜电位测定法，所述荧光膜电位测定法用电压依赖性荧光染料检测细胞中膜电位的变化（专利文献1）。另外，通过将玻璃电极附着（封接）于细胞膜来电学检测膜电位的膜片钳法也是已知的。此外，最近已开发出自动膜片钳法，所述自动膜片钳法使用在每个孔中具有与玻璃电极的末端相对应的开口的多孔膜片板（patch plate），以在每个孔中通过自动封接细胞膜和膜片电极（patch electrode）来检测膜电位（非专利文献1）。

存在的情况是，尽管常规的荧光膜电位测定法适用于评价大量样本，但它们在测定的精确度和可适用的离子通道的范围方面存在局限性。另外，尽管膜片钳法具有高测定精确度并允许从测定中获得大量信息，但它由于一次只能够测定少量样本，因而具有低效率。此外，尽管自动膜片钳法采用了允许同时对大量样本进行评价的结构，但该膜片的效率是低的，从而使得该方法不适合于高通量筛选。另外，自动膜片钳法还具有设备和运行成本高的问题。

在靶向离子通道筛选的情况下，由于内源性配体是离子，因此，难以预测能够与靶标结合的结构。因此，在构建靶向离子通道的筛选系统时，与靶向受体和其它蛋白质的情况相比，允许施加大量受试化合物的高通量甚至是更重要的。另外，在靶向离子通道筛选的情况下，配体的优化常常是困难的，从而导致在高通量的同时还需要测定的精确度。

然而，正如前面所描述的，用于测定细胞中膜电位的微小变化的常规荧光膜电位测定法具有精确度和适用范围方面的问题，而自动膜片钳法具有效率和成本方面的问题。因此，还需构建表现出有利的精确度和优异的效率的靶向离子通道的筛选系统。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2006-126073号公报

非专利文献

非专利文献1：Tim J.Dale等,Mol.Biosyst.2007,3,714-722

发明内容

本说明书的公开内容的目的是构建靶向离子通道并具有优异的效率的筛选系统。

本发明的发明人注意到，靶向离子通道的筛选系统被迫使用基于检测活细胞的膜电位的评价技术，这些评价技术所具有的问题使得难以构建筛选系统。因此，为了构建能够应用更简单的评价技术而不是这些常规评价技术的筛选系统，进行了各种研究。结果，本发明的发明人发现，一旦用来自于细胞外的刺激诱导去极化后，由于细胞中离子浓度的变化、典型地由于细胞内钠（Na）离子浓度的增加而发生细胞死亡的细胞作为用于检测受试化合物对离子通道的作用的介质（筛选用材料），使得可以通过利用细胞死亡或者引起细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位作为指标来检测受试化合物对离子通道的活化或抑制。根据本说明书的公开内容，提供了以下几个方面。

根据本说明书的公开内容，提供了化合物的筛选用材料，所述材料包含细胞，所述化合物作用在靶离子通道上，所述细胞保持有至少一种第一DNA，所述第一DNA编码电压依赖性Na离子通道，所述电压依赖性Na离子通道已被抑制而不失活，并且其中K离子通道已被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深。

另外，根据本说明书的公开内容，提供了筛选方法，所述方法包括下面的步骤：通过利用上述细胞的存活或死亡作为指标，使用上述筛选用材料的上述细胞来检测受试化合物对上述靶离子通道的作用。

此外，根据本说明书的公开内容，提供了用于筛选作用在离子通道上的化合物的装置，所述装置包含：细胞容纳单元，所述细胞容纳单元提供有容纳细胞的一个或多个区域；以及测定单元，所述测定单元测定所述一个或多个区域中的上述细胞的死亡。

附图说明

图1是示出了本说明书中公开的筛选方法的实例的概述的图。