[发明专利]引物珠粒

权利要求书

1.一种方法，包含：

a）提供具有标准化、非共价结合的寡核苷酸的珠粒；和

b）在酶促反应期间将所述寡核苷酸从所述珠粒逐渐释放。

2.根据权利要求1所述的方法，包括通过将标准化量的纯化的寡核苷酸捕获在所述珠粒上来纯化粗寡核苷酸溶液，从而制备所述珠粒的初始步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中纯化包括使粗寡核苷酸溶液脱盐和捕获标准化量的寡核苷酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述标准化、非共价结合的寡核苷酸由皮摩尔量的引物组成。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述珠粒是由具有非极性疏水性表面的无孔玻璃制成。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述珠粒是由具有非极性疏水性表面的多孔玻璃制成。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述珠粒是由具有非极性疏水性表面的多孔或无孔玻璃制成，所述疏水性表面包括选自C₃到C₂₀的线性或分支烷基链、芳基、苯甲基、萘基、菲基和三苯甲基。

8.根据权利要求1所述的方法，另外包括通过使玻璃珠与硅烷反应来制备所述具有标准化、非共价结合的寡核苷酸的珠粒的初始步骤，其中所述硅烷包括选自由以下各项组成的群组的至少一种：三烷基(烷氧基)硅烷、二烷基(二烷氧基)硅烷、芳基(烷基)(二烷氧基)硅烷、芳基(三烷氧基)硅烷、二芳基(二烷氧基)硅烷、三芳基(烷氧基)硅烷、氟代烷基烷氧基硅烷和烷基二(三烷氧基硅烷)。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述珠粒包括非极性疏水性表面，所述疏水性表面包括表面(芳基)_n-X-烷基，其中所述芳基选自由苯基、苯甲基、联苯基、萘基、三苯甲基组成的群组；X=C、O、S、SC(O)N、OC(O)N、NC(O)和N；并且n=1到3，n是等于或大于1的有限整数。

10.根据权利要求2所述的方法，其中纯化粗寡核苷酸溶液包括结合含有至少一种污染物的所述粗溶液中具有5'-疏水性部分的寡核苷酸。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述5'-疏水性部分是4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMT）并且所述污染物是不含DMT的核酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述标准化、非共价结合的寡核苷酸包括至少一个反向引物和一个正向引物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述标准化、非共价结合的寡核苷酸另外包括至少一个核酸探针。

14.根据权利要求10所述的方法，另外包括在将标准化量的纯化的寡核苷酸捕获在所述珠粒上之后

i）将所述珠粒暴露于含有10%到100%甲醇、乙醇、乙腈或丙酮的水溶液；和

ii）随后，将所述珠粒暴露于含有0.1M到1.0M浓度的单烷基乙酸铵、二烷基乙酸铵、三烷基乙酸铵的pH范围为6到9.5的溶液。

15.根据权利要求10所述的方法，另外包含用结合缓冲液稀释所述粗溶液，并将所得到的溶液与多个经过灌注的珠粒混合，从而得到结合含DMT的寡核苷酸的珠粒。

16.根据权利要求15所述的方法，另外包括用洗涤缓冲液洗涤所述结合含DMT的寡核苷酸的珠粒，所述洗涤缓冲液去除污染物，但不去除结合的含DMT的寡核苷酸。

17.根据权利要求15所述的方法，另外包含将所述结合的含DMT的寡核苷酸的DMT基团裂解，从而得到结合不含DMT的寡核苷酸的珠粒的步骤。

18.根据权利要求15所述的方法，其中将每体积2:1到1:2体积的所述结合缓冲液添加到所述粗溶液中。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有标准化、非共价结合的寡核苷酸的珠粒包括具有非共价结合的不含DMT的寡核苷酸的珠粒，并且所述方法另外包括用聚烷基硅氧烷溶液涂覆所述珠粒以得到经过涂覆的寡核苷酸结合珠粒。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有标准化、非共价结合的寡核苷酸的珠粒包括具有非共价结合的不含DMT的寡核苷酸的珠粒，并且所述方法另外包括处理所述珠粒以得到硅烷化的寡核苷酸结合珠粒。